伐地那非通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平治療肺動(dòng)脈高壓的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(pulmonaryarterialhypertension，PAH)是一類多病因、進(jìn)展性的疾病，其定義為靜息狀態(tài)右心導(dǎo)管(RHC)測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓大于等于25mmHg，最終進(jìn)展為右心衰竭，直至死亡。肺動(dòng)脈高壓是多種生理途徑和細(xì)胞類型引起的多因素的病理生理改變，包括肺血管收縮、增殖，血管阻塞性重構(gòu)，炎性浸潤(rùn)及原位血栓形成等機(jī)制。越來(lái)越多的研究表明，氧化應(yīng)激參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病過(guò)程。氧化應(yīng)激被定義為氧化物的增加（如過(guò)氧化氫、超

2、氧陰離子等）伴或不伴有抗氧化物或抗氧化酶（如超氧化物歧化酶）的降低。增加的氧化物不但能夠通過(guò)氧化特定的生物分子，直接損傷組織器官，包括脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化，而且可以與一氧化氮(NO)結(jié)合，導(dǎo)致毒性分子過(guò)氧亞硝酸的產(chǎn)生和內(nèi)皮一氧化氮合成酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)的脫偶聯(lián)。
　　在過(guò)去幾年里，肺動(dòng)脈高壓的藥物治療有了很大進(jìn)展，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)顯示使用靶向藥物治療的肺動(dòng)脈高壓患者比安慰劑組的死

3、亡率下降了43％，住院率下降了61％31。目前應(yīng)用于肺動(dòng)脈高壓治療的靶向藥物有以下3類:1）前列環(huán)素類似物;2）內(nèi)皮素受體拮抗劑;3）5-磷酸二酯酶抑制劑。其中5-磷酸二酯酶抑制劑包括西地那非、伐地那非和他達(dá)拉非，5-磷酸二酯酶抑制劑在肺血管系統(tǒng)中大量表達(dá)。5-磷酸二酯酶抑制劑通過(guò)NO/cGMP通路起到擴(kuò)張血管和抗增殖作用。5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase-type5，PDE5)是在肺組織中廣泛表達(dá)的的磷酸二酯酶異構(gòu)酶

4、，它能夠在鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(guanylatecyclase)的作用下降解環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclicguanosinemonophosphate，cGMP)，引起血管收縮。PDE5抑制劑，包括西地那非(sildenafil)和他達(dá)拉非（tadalafil），目前已經(jīng)被批準(zhǔn)用于肺動(dòng)脈高壓的臨床治療。
　　伐地那非(vadenafil)，屬于新型PDE5抑制劑。與傳統(tǒng)的PDE5抑制劑相比，它完全溶于水和乙醇，對(duì)PDE5的特異性作用更強(qiáng)。20

5、11年，通過(guò)一項(xiàng)臨床雙盲、隨機(jī)、安慰劑實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)伐地那非能夠有效的改善PAH患者的運(yùn)動(dòng)能力、血流動(dòng)力學(xué)指數(shù)和心功能，但機(jī)制尚不明確。在勃起功能障礙的基礎(chǔ)和臨床研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)除了PDE5抑制功能，PDE5抑制劑還能夠通過(guò)抑制氧自由基形成，降低NADPH氧化酶起到強(qiáng)大的抗氧化作用，從而緩解內(nèi)皮功能障礙和血管重構(gòu)，但其他PAH靶向藥物，如依前列醇(epoprostenol)并沒(méi)有此功能。Ghofrani等報(bào)道給予PAH患者短期伐地

6、那非治療后，顯示雖然伐地那非能引起肺血管收縮，但其對(duì)肺循環(huán)血管缺乏特異性，另外，伐地那非中長(zhǎng)期治療也有個(gè)案報(bào)道，顯示其對(duì)PAH的治療并沒(méi)有特殊效果。因此，伐地那非治療PAH的有效性及耐受性仍值得進(jìn)一步商榷。
　　2009年，荊志成教授及其課題組，通過(guò)對(duì)45名PAH患者的研究，顯示1年的伐地那非治療能夠有效地治療PAH。2011年，該課題組繼續(xù)進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑-對(duì)照及多中心的研究。結(jié)果顯示與西地那非和他達(dá)拉非不同，伐地那

7、非單藥治療即能夠有效的延緩PAH患者的臨床惡化程度，改善其血流動(dòng)力學(xué)變化。然而伐地那非治療肺動(dòng)脈高壓的具體機(jī)制仍不明確。
　　鑒于目前伐地那非治療PAH功能研究的缺乏，本課題收入15名特發(fā)性PAH患者，同時(shí)以野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠為體內(nèi)模型，以H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激內(nèi)皮細(xì)胞為體外模型，研究伐地那非治療PAH的機(jī)制研究和可能涉及的信號(hào)通路，為PAH的治療提供了依據(jù)。研究分以下三部分:
　　第一部分伐地那非改善氧化應(yīng)激并治療特

8、發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的臨床研究
　　本研究選擇特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者作為研究對(duì)象，分析了伐地那非對(duì)特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者的治療作用，及其對(duì)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改善作用。
　　1)我們選取了EVALUATION研究中的15名特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的患者，并選擇了年齡及性別與之相匹配的健康人群作為對(duì)照。入選患者給予伐地那非每次5mg，每日1次口服1個(gè)月，若患者未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，則加量至每次5mg，每日2次繼續(xù)口服2個(gè)月。
　　2)我們

9、于基線及3個(gè)月后評(píng)估完成以下內(nèi)容:標(biāo)準(zhǔn)病史與體格檢查，6分鐘步行距離，WHO肺動(dòng)脈高壓功能分級(jí)，血生化指標(biāo)，心電圖，肺功能檢查，和完整的右心導(dǎo)管檢查所測(cè)血流動(dòng)力學(xué)資料。結(jié)果顯示3個(gè)月的伐地那非治療能顯著改善特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者WHO功能分級(jí)、六分鐘步行距離、心指數(shù)、肺血管阻力等指標(biāo)。盡管跟用藥前相比較，患者平均肺動(dòng)脈壓力、肺毛細(xì)血管楔壓、平均右房壓力較前有降低，但并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果說(shuō)明伐地那非能夠改善肺動(dòng)脈高壓患者臨床癥狀及血流

10、動(dòng)力學(xué)變化。
　　3)隨后我們采用商品化試劑盒測(cè)量了肺動(dòng)脈高壓患者及健康對(duì)照組血液中一氧化氮、丙二醛、8-異前列素F2α、3-硝基酪氨酸、超氧化物歧化酶等氧化應(yīng)激及氮化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物的水平。發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓患者血漿中氧化損傷產(chǎn)物丙二醛、8-異前列素F2α、3-硝基酪氨酸明顯高于正常人，氧化應(yīng)激保護(hù)性產(chǎn)物一氧化氮、超氧化物歧化酶明顯低于正常對(duì)照者。伐地那非治療3個(gè)月后，氧化損傷產(chǎn)物8-異前列素F2α及3-硝基酪氨酸水平均較前降低，但仍高

11、于正常人，而丙二醛的水平并沒(méi)有明顯改變。血管擴(kuò)張產(chǎn)物一氧化氮較治療前明顯升高，基本恢復(fù)正常水平?？寡趸赋趸锲缁篙^治療前升高，與正常人相比，仍處于較低水平。以上以上結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈高壓患者體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激水平，抗氧化能力明顯較正常人減弱。而伐地那非治療能夠降低患者的氧化應(yīng)激水平，改善其抗氧化能力，起到保護(hù)性作用。
　　第二部分伐地那非改善野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠氧化應(yīng)激水平的研究
　　本研究選擇了34只雄性SP

12、F級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200-220g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、野百合堿模型組以及伐地那非治療組。給予50mg/kg野百合堿21天后，伐地那非治療組大鼠予1mg/kg/d灌胃共21天。之后進(jìn)行如下研究:
　　1)應(yīng)用右心導(dǎo)管檢查術(shù)測(cè)量大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)MCT組大鼠的mPAP、RVSP和PVR明顯高于正常對(duì)照組，而CO則明顯低于正常對(duì)照組。給予伐地那非治療后，伐地那非組大鼠的mPAP、RVSP和PVR

13、較MCT組分別降低41％、25％和26％。以上結(jié)果與我們臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了伐地那非對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的改善作用。
　　2)為研究伐地那非對(duì)血流動(dòng)力學(xué)改善的原因，我們對(duì)大鼠肺組織進(jìn)行了組織學(xué)染色并應(yīng)用相關(guān)軟件對(duì)血管組織進(jìn)行測(cè)量。與正常對(duì)照組相比，野百合堿組大鼠的％WT和％WA明顯增高。而給予伐地那非治療后，伐地那非組的％WT和％WA明顯降低。以上結(jié)果在＜50μm、50-100μm、100-200μm直徑的肺血管中均有所體現(xiàn)。

14、之后我們通過(guò)α-SMA抗體染色，檢測(cè)大鼠的血管肌化程度。跟正常對(duì)照組相比，野百合堿組血管肌化程度顯著增加，鏡下觀察平滑肌細(xì)胞明顯肥大增生。給予伐地那非治療后，伐地那非組肌化程度較MCT組降低了39％，平滑肌細(xì)胞增生肥大有所改善。最后我們對(duì)肺血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行了PCNA及TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)伐地那非對(duì)血管厚度的改善是通過(guò)誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增值，同時(shí)促進(jìn)其凋亡而實(shí)現(xiàn)的。
　　我們應(yīng)用wersternblot的方法及商品化試劑盒

15、，研究了伐地那非治療肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)機(jī)制。與正常對(duì)照組相比，野百合堿組大鼠血漿及肺組織內(nèi)NO的濃度降低，.給予伐地那非治療后，跟野百合堿組相比，伐地那非組血漿及肺組織內(nèi)NO水平均較前恢復(fù)。原因是通過(guò)伐地那非上調(diào)eNOS蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。之后我們發(fā)現(xiàn)伐地那非能夠改善大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，與我們臨床試驗(yàn)結(jié)果相一致。為了進(jìn)一步研究可能的機(jī)制，我們選擇了氧化應(yīng)激過(guò)程中主要的酶，NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶，進(jìn)行下一步研究。結(jié)果顯示與正常對(duì)

16、照組相比，野百合堿大鼠大鼠體內(nèi)NADPH氧化酶催化亞基，NOX2和NOX4，的水平明顯上調(diào)，但激活亞基RAC1水平并沒(méi)有明顯變化。伐地那非治療能顯著改善NOX2和NOX4的表達(dá)水平，卻同樣不影響RAC1亞基的表達(dá)水平。相反，MCT組大鼠體內(nèi)SOD活性較正常對(duì)照組相比明顯降低，而伐地那非治療后，SOD活性得到了顯著改善。以上結(jié)果提示，伐地那非對(duì)氧化應(yīng)激水平的改善，其中一部分是通過(guò)改善NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶而實(shí)現(xiàn)的。
　　第

17、三部分伐地那非通過(guò)BMP信號(hào)通路改善內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制研究
　　通過(guò)第一部分和第二部分的體內(nèi)研究，我們明確了伐地那非能改善氧化應(yīng)激同時(shí)治療肺動(dòng)脈高壓，但具體機(jī)制仍不清楚。因此第三部分，我們應(yīng)用CRL-1730內(nèi)皮細(xì)胞系為研究模型，給予不同劑量外源性H2O2造成其氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步研究了伐地那非對(duì)氧化應(yīng)激損傷保護(hù)性作用的具體機(jī)制。
　　1)通過(guò)MTT及TUNEL的方法，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞活力顯著降低，伐

18、地那非各劑量組與H2O2組比較，細(xì)胞活力顯著升高，且具有明顯的劑量依賴性。與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著增高，給予伐地那非處理后，細(xì)胞凋亡率較前明顯改善，且具有劑量依賴性。以上結(jié)果于體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果相互印證:伐地那非對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起到了強(qiáng)烈的保護(hù)性作用，且該作用呈劑量依賴性。
　　2)之后我們檢測(cè)了骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMPs）信號(hào)通路在各組細(xì)胞中的表達(dá)，BMP信號(hào)通路廣泛參與了肺動(dòng)

19、脈高壓、動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病。結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激隨時(shí)能夠上調(diào)BMP受體1A、BMP受體1B、BMP受體2，同時(shí)上調(diào)胞漿內(nèi)p-smad水平，最后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子MSX2的表達(dá)。而伐地那非能夠改善上述通路，起到保護(hù)性作用。
　　3)最后我們應(yīng)用BMP信號(hào)通路的抑制劑，Dorsomorphin干預(yù)細(xì)胞，并通過(guò)TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著增高，伐地那非組與H2O2組比較，細(xì)