Wnt信號通路參與中腦多巴胺神經(jīng)元損傷的研究.pdf

1、經(jīng)典Wnt信號通路在中腦多巴胺神經(jīng)元發(fā)育的過程中至關(guān)重要，一些研究提示這條通路可能與帕金森病(Parkinson'disease，PD)發(fā)病相關(guān)，但都一致缺乏基因敲除小鼠的證據(jù)。Wnt信號通路中重要的分子包括低密度脂蛋白5（LRP5）、低密度脂蛋白6（LRP6）、β-catenin。LRP5/6是Wnt信號通路中共受體，能分別與Wnt-fzd形成三聚物。β-catenin是調(diào)控Wnt信號通路的重要分子，有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在中腦

2、DA神經(jīng)元發(fā)育中不可或缺。本實驗采用cre-loxp策略制備DA神經(jīng)元內(nèi)選擇性敲除LRP5，LRP6和β-catenin的條件性基因敲除(CKO)小鼠。首先，通過地高辛標記的β-catenin原位雜交探針，檢測了β-catenin mRNA在黑質(zhì)區(qū)域的表達情況。結(jié)果顯示，β-catenin mRNA陽性細胞在對照組正常小鼠中腦黑質(zhì)致密帶(SNc)處有表達。而β-catenin CKO小鼠該區(qū)域的原位雜交信號明顯下降。因此，原位雜交表明β

3、-catenin CKO小鼠的中腦黑質(zhì)內(nèi)β-catenin明顯下降，一些殘存的信號可以是非多巴胺神經(jīng)表達的β-catenin。由于LRP5 mRNA和LRP6 mRNA原位雜交信號廣泛分布，信號較弱。因此我們采用免疫組化方法對敲除效率進行驗證。市售的抗體同時識別LRP5和LRP6，因此對三組小鼠（LRP5 CKO，LRP6 CKO和LRP5/LRP6雙重CKO）進行了驗證。正常對照組小鼠黑質(zhì)LRP5/LRP6陽性信號強，大量與TH陽性細

4、胞共標。LRP5/LRP6雙重CKO小鼠黑質(zhì)處LRP5/LRP6無陽性表達，與黑質(zhì)TH陽性細胞不共標。與正常組小鼠相比，LRP5 CKO與LRP6 CKO小鼠LRP5/LRP6陽性信號減弱，與TH陽性細胞共標的細胞減少。本結(jié)果間接證明LRP5 CKO和LRP6 CKO黑質(zhì)內(nèi)上述基因被敲除。驗證LRP5，LRP6和β-catenin成功敲除后，再通過免疫組織化學方法觀察這三種CKO小鼠，成年時期中腦黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶(Tyrosinehy

5、droxylase，TH)免疫反應(yīng)陽性數(shù)量是否發(fā)生改變。發(fā)現(xiàn)LRP5，LRP6缺失后小鼠中腦DA神經(jīng)元的數(shù)量沒有改變，而β-catenin敲除的小鼠中腦DA神經(jīng)元的數(shù)量下降，由此驗證β-catenin參與DA神經(jīng)元發(fā)育的觀點。繼而在這些小鼠上進行PD發(fā)病的環(huán)境損害因素的測試，采用的方法是腹腔注射神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)15mg/kg，每日一次，持續(xù)注射5周后，正常小鼠組、LRP5 CKO小鼠組和LR

6、P6 CKO小鼠組黑質(zhì)TH-陽性神經(jīng)元數(shù)量均降低。但是LRP5和LRP6 CKO小鼠TH陽性細胞下降的程度低于MPTP處理的正常對照小鼠。此結(jié)果提示在中腦DA神經(jīng)元中特定敲除LRP5和LRP6在一定程度上保護了DA神經(jīng)元抵抗神經(jīng)毒MPTP的損害。另外，雖然β-catenin CKO小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元的數(shù)量在生理鹽水處理時就比較少，但是經(jīng)MPTP處理后β-cateninCKO小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)的數(shù)量卻與正常小鼠相當。表明β-catenin缺