甲型流感病毒亞型間血清學交叉反應特征研究及反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化.pdf

1、甲型流感病毒嚴重危害人類健康，由于其變異引發(fā)的大流行對人類造成嚴重威脅，近年來人感染禽流感病毒(H5N1)和甲型H1N1流感的流行，進一步提示加強甲型流感病毒的研究和控制的重要性。
　　 血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是甲型流感病毒編碼的糖蛋白，變異性強，根據(jù)抗原性不同可進一步分為16個HA亞型(H1～H16)和9個NA亞型(N1～N9)。盡管HA和NA是流感病毒主要的免疫原，但由于HA和NA的變異性強，亞型眾多，而目前甲型

2、流感病毒16個HA和9個NA不同亞型之間的免疫交叉關系尚未系統(tǒng)研究，對流感病毒亞型特異性免疫檢測技術的建立和疫苗的研發(fā)提出了嚴峻的考驗。為此，本研究對甲型流感病毒16個亞型的HA1和9個亞型NA的交叉反應性進行了研究，以期闡明其免疫反應特征，為甲型流感病毒免疫檢測技術和通用疫苗的研制提供可行性的理論依據(jù)。另一方面，近年來反向遺傳系統(tǒng)的發(fā)明為人工改造甲型流感病毒和研發(fā)疫苗提供了關鍵技術平臺，但現(xiàn)有系統(tǒng)的拯救效率有待提高，本研究擬通過對甲型

3、流流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的轉錄/表達載體的改建提高其拯救效率。
　　 一、甲型流感病毒HA和NA血清學交叉反應特征研究
　　 對本實驗選取的甲型流感病毒16個亞型的HA基因和9個亞型的NA基因的序列進行了分析，結果表明，16個HA和9個NA的核苷酸與氨基酸序列的進化樹都主要向兩個趨勢進化，16個HA核苷酸序列之間的同源率在28％～76.7%之間，其氨基酸序列之間的同源率在36.2%～78.5%之間，9個NA亞型核苷酸序列之

4、間的同源率在43.1%～70.4%之間，其氨基酸序列之間的同源率在37.9%～66.6%之間。盡管16個HA和9個NA基因的預測B細胞線性表位分布區(qū)域一致，但其具體表位組成卻存在差異，這些信息為進行各亞型之間的血清學交叉反應以及確定亞型特異性表位序列提供研究方向，進而為研究HA和NA的結構與功能、免疫識別、構建HA和NA的突變體以及選擇表達新型HA和NA分子、研發(fā)診斷和基因工程疫苗奠定了基礎。
　　 隨后將PCR擴增的經(jīng)密碼子優(yōu)

5、化的16個HA1和9個NA基因克隆到改建的gp67-pFastBac1載體中，獲得了25個重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒分別感染Sf9細胞，分別收取上清和細胞用抗6×His抗體進行Westernblot分析。結果表明，16個HA1和9個NA基因的表達產(chǎn)物分子質(zhì)量分別約為52.5kD與71.6kD，與預期相符，并且16個HA1和9個NA基因還呈分泌性表達。其中H5-HA1和H9-HA1經(jīng)Ni柱純化后的純度達90%左右，回收率分別為0.5%和

6、0.9%。同時，將16個亞型的HA和9個亞型的NA基因克隆到5型重組腺病毒載體中，得到了25個重組腺病毒。分別將25個重組腺病毒通過滴鼻途徑免疫BALB/c小鼠，制備了相應亞型的抗體，三次免疫后ELISA檢測陽轉率為100%，ELISA檢測的抗體效價約為1∶6400左右。利用桿狀病毒系統(tǒng)表達的各個亞型的目的蛋白作為抗原，利用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠制備的血清作為抗體，通過ELISA方法確定16個HA亞型及9個NA亞型之間的血清學交

7、叉反應關系。結果表明，HA1和NA各亞型之間的交叉反應關系錯綜復雜，H2、H5、H7亞型與其他亞型之間的交叉反應弱，而H6、H12、H16與其他亞型之間的交叉反應強。N1、N2亞型與其他亞型之間的交叉反應強，HA1和NA各亞型之間的交叉反應結果與其序列分析的結果存在一定的差異。
　　 二、甲型流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 利用RT-PCR的方法擴增了甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株8個基因片斷，克隆入p

8、ⅣⅦ載體中，其中在PB1片段中引入了3個沉默突變標簽。將8個功能質(zhì)粒共轉染293T和MDCK混合培養(yǎng)細胞，利用細胞病變、RT-PCR、電鏡技術等證明該系統(tǒng)可成功拯救甲型流感病毒。為提高甲型流感病毒的拯救效率，用人工合成的SCPI啟動子[1]插入PⅣⅦ載體，構建出pⅣVS質(zhì)粒，再將A/PR/8/34(H1N1)的8個基因片斷克隆入pⅣVS載體中，把優(yōu)化后的8個功能質(zhì)粒共轉染293T和MDCK混合細胞，在共轉染后的24h、48h、72h及9