基于細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建組織工程化骨實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨組織工程研究為腫瘤切除、創(chuàng)傷、先天性畸形等所致骨缺損的修復(fù)提供了新思路，其中種子細(xì)胞是核心問(wèn)題之一。本研究以骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)，構(gòu)建出骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片。并提出了新的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞聚集體構(gòu)建方法——骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片(Bonemarrowstromalosteoblastcellsheet)技術(shù)，其主要策略是提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外擴(kuò)增后，誘導(dǎo)為骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞，體外擴(kuò)增純化骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞，

2、按照特定的培養(yǎng)程序在體外構(gòu)建出骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片，擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞在細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)表面實(shí)現(xiàn)三維立體生長(zhǎng)，它的特點(diǎn)在于：①本研究構(gòu)建的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片分為三層：富含基質(zhì)層、中間層和富含細(xì)胞層，從而使形成的細(xì)胞膜片具有生長(zhǎng)的動(dòng)力性和方向性；②保持了擴(kuò)增細(xì)胞良好的功能表型，在細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)兼顧了細(xì)胞的分化能力；③良好的生物相容性和低免疫源性；④較高的種子細(xì)胞利用效率；⑤通過(guò)與天然支架材料支撐賦形，可以進(jìn)行特定形態(tài)的

3、組織構(gòu)建。
　　本研究對(duì)構(gòu)建骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的理化性質(zhì)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)和生化成分進(jìn)行了分析；通過(guò)體外三維構(gòu)建和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估了骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片在體外形成骨樣組織的能力和在體內(nèi)形成特定形態(tài)骨樣組織的能力。進(jìn)而提出新的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建策略，研究不同形態(tài)骨樣組織的構(gòu)建方法，探索新的體外構(gòu)建移植體修復(fù)骨缺損的思路。
　　實(shí)驗(yàn)一骨髓充成骨胞膜片間質(zhì)細(xì)體外建構(gòu)
　　目的：本實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片組織學(xué)結(jié)構(gòu)

4、和生化成分進(jìn)行了分析；通過(guò)體外三維構(gòu)建評(píng)估了骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片體外骨樣組織的形成能力。方法：骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的體外構(gòu)建：切取兔四肢長(zhǎng)骨干骺端，通過(guò)離心分層法制備原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將原代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并分為六等分，平均接種至六個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶底壁有80％被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼滿后，加入誘導(dǎo)液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底，消化，搜集細(xì)胞。將獲取細(xì)胞高密度接種至三個(gè)九厘米直徑培養(yǎng)皿中。孵育十四天后，觀察骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的形

5、成情況，并進(jìn)行組織學(xué)染色和電鏡觀察。結(jié)果：經(jīng)過(guò)體外孵育，骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片為半透明膜狀物，有彈性，內(nèi)富含有質(zhì)硬的白色結(jié)節(jié)，可用金屬鑷鉗夾操作。HE染色證實(shí)有骨基質(zhì)形成，并形成類似骨陷窩樣的組織結(jié)構(gòu)。Vonkossa染色證實(shí)有礦化成分在基質(zhì)中合成。觀察：發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片分為三層：富含基質(zhì)層、中間層和富含細(xì)胞層。結(jié)論：提出骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的兩極學(xué)說(shuō)（靜止極和增殖極），建立了一種新的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建技術(shù)，骨髓間充

6、質(zhì)成骨細(xì)胞膜片是一種由骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞和基質(zhì)（自行分泌）組成的聚集體，相信它在進(jìn)一步的體外自體骨移植體的構(gòu)建中具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
　　實(shí)驗(yàn)二骨髓充成骨胞膜片/狀間質(zhì)細(xì)管珊瑚合體移植裸鼠復(fù)皮下成骨實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：在新的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建技術(shù)下，觀察骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片在無(wú)免疫動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育成管狀骨樣組織的能力。方法：靜態(tài)培養(yǎng)條件下，骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的靜止極朝向管狀天然珊瑚，將其均勻纏繞在管狀珊瑚外表面，進(jìn)

7、行卷層樣復(fù)合，經(jīng)體外孵育4周后，觀察聚集體之間的融合情況，并通過(guò)組織學(xué)染色觀察組織成熟情況。最后將骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片/珊瑚復(fù)合體植入裸鼠皮下，分為8周組、12周組，了解成骨情況。結(jié)果：大體觀察，體外孵育四周后，在管狀珊瑚體外周部分的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片卷層之間發(fā)生了組織融合，并形成了較成熟的骨樣組織，而在管狀珊瑚體的中央部分，有非常明顯成熟的骨樣組織形成。結(jié)論：在良好營(yíng)養(yǎng)交換的環(huán)境下，骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片具備繼續(xù)成熟并發(fā)育為骨樣

8、組織的能力，調(diào)整骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的卷層方向（靜止極和增殖極的朝向）可為骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的體外三維構(gòu)建提供新的塑形方法。
　　實(shí)驗(yàn)三骨髓充成骨胞膜片/種植體/間質(zhì)細(xì)珊瑚合體移植裸鼠復(fù)皮下成骨實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：利用新的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建技術(shù)，在無(wú)免疫動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建出內(nèi)有種植體的骨樣組織，以探索骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片體內(nèi)構(gòu)建帶有種植體骨樣組織的可行性。方法：按實(shí)驗(yàn)一所述方法構(gòu)建出的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片后，以構(gòu)

9、建好的種植體/珊瑚復(fù)合體為賦形支撐體，骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的增殖極朝向種植體/珊瑚復(fù)合體，將其均勻纏繞在種植體/珊瑚復(fù)合體外表面。體外孵育四周后，觀察聚集體之間的融合情況，最后將骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片/種植體/珊瑚復(fù)合體植入裸鼠皮下，在8周后，取出標(biāo)本。從大體形態(tài)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)等方面評(píng)價(jià)形成骨樣組織情況。結(jié)果：通過(guò)此策略構(gòu)建的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片/種植體/珊瑚復(fù)合體具有良好的生物相容性。形成的骨樣組織保持著良好的初始外形，組織學(xué)結(jié)構(gòu)類

10、似于天然骨組織，含有豐富的礦化物質(zhì)和膠原纖維。結(jié)論：骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片在體內(nèi)具有良好的骨樣組織形成能力。形成的組織結(jié)構(gòu)均勻，細(xì)胞表型維持良好，并為下一步頜骨缺損修復(fù)探索了新的方法。
　　實(shí)驗(yàn)四骨髓充成骨胞膜片附移植實(shí)驗(yàn)研究間質(zhì)細(xì)貼
　　目的：研究骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片貼附后成骨的構(gòu)建方法。方法：按實(shí)驗(yàn)一所述方法構(gòu)建出骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片后，以圓片狀珊瑚為支撐體，將其均勻平鋪在珊瑚一面。體外短時(shí)間孵育，使骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)

11、胞膜片與珊瑚牢靠貼附后，將構(gòu)建的圓片狀移植體植入細(xì)胞供體動(dòng)物（新西蘭兔）去除骨膜的顱骨表面。體內(nèi)孵育8周、12周后，取出標(biāo)本。從大體形態(tài)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)等方面了解貼附成骨情況。結(jié)果：通過(guò)上述策略，可以形成形態(tài)穩(wěn)定的圓盤狀骨樣組織，有一定的機(jī)械性能，有大量的新骨樣組織形成。結(jié)論：此策略所形成的貼附后骨樣組織與膜狀成骨、軟骨成骨貼附移植后的情況不同。
　　實(shí)驗(yàn)五骨間質(zhì)髓充成骨胞膜片復(fù)兔顱極細(xì)修骨限缺的損實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：運(yùn)用骨髓間

12、充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片技術(shù)，探索在無(wú)支撐體條件下修復(fù)兔顱骨極限缺損的方法。方法：按實(shí)驗(yàn)一所述方法構(gòu)建出骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片。同時(shí)設(shè)自體髂骨移植的陽(yáng)性對(duì)照組和單純珊瑚材料的陰性對(duì)照組。將其分別植入兔顱骨極限缺損處，8周和12周后采用X線片，HE染色、Masson’s三色染色法等觀察、比較骨缺損修復(fù)的情況。結(jié)果：組織學(xué)結(jié)構(gòu)顯示骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建出了骨樣組織。骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片修復(fù)顱骨缺損的能力強(qiáng)，且與自體髂骨修復(fù)的情況相近。珊瑚組材

13、料無(wú)成骨能力。結(jié)論：骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建的組織工程骨可成為一種良好的骨缺損修復(fù)材料。
　　實(shí)驗(yàn)六骨髓充成骨胞膜片/種植體/間質(zhì)細(xì)珊瑚合體修復(fù)復(fù)頜羊下?lián)p實(shí)驗(yàn)研骨缺的究
　　目的：利用新的骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片構(gòu)建技術(shù)，探索構(gòu)建特定形態(tài)大塊骨樣組織的思路，并進(jìn)行大動(dòng)物下頜骨缺損修復(fù)。方法：以山羊?yàn)閯?dòng)物模型，按實(shí)驗(yàn)一所述方法構(gòu)建出骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片后，以珊瑚為支撐體構(gòu)建山羊部分下頜骨外形，并將種植釘放入支撐材料中，用此珊

14、瑚/種植釘作為骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片內(nèi)支撐體。骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片的增殖極朝向支撐體，然后，將骨髓間充質(zhì)成骨細(xì)胞膜片小心纏繞在內(nèi)支撐體外周。進(jìn)行體外孵育4周后。將此方法獲得的部分下頜骨移植體植入制作好的供體動(dòng)物下頜骨缺損處，12周后，取出標(biāo)本，進(jìn)行大體外形、組織學(xué)形態(tài)觀察，了解大動(dòng)物下頜骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果：通過(guò)此策略，在內(nèi)支撐體外構(gòu)建的移植體具有穩(wěn)定的外形，能在動(dòng)物缺損部位形成理想的外形，組織學(xué)結(jié)構(gòu)顯示構(gòu)建的骨樣組織具有較好的質(zhì)量。