靶向PPARγ基因RNA干擾對(duì)激素抑制家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、背景與目的:近幾十年來隨著激素在多種疾病治療過程中的使用越來越多,隨之引發(fā)的激素性股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)也成為骨科常見疾病之一。股骨頭壞死導(dǎo)致患者髖部疼痛、髖關(guān)節(jié)功能障礙,多數(shù)病程難以逆轉(zhuǎn),因此預(yù)防激素性O(shè)NFH的發(fā)生尤為重要。激素性O(shè)NFH的確切發(fā)病機(jī)制仍不清楚,但國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究,提出了很多學(xué)說,主要有脂肪代謝紊亂學(xué)說、脂肪栓塞學(xué)說、骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化學(xué)說

2、、血管內(nèi)凝血學(xué)說、骨內(nèi)高壓學(xué)說、骨質(zhì)疏松學(xué)說等。Cui等研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可導(dǎo)致股骨頭骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞異常增殖肥大,骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積而變性死亡。李月白等研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Marrow stromal cells,MSCs)內(nèi)成脂轉(zhuǎn)錄因子PPARγmRNA的高表達(dá),而抑制成骨基因Osteocalcin mRNA的表達(dá),這可能與激素性骨壞死的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。表明MSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中,PPARγ基因起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用,是

3、發(fā)生激素性骨壞死的一個(gè)重要靶基因。本實(shí)驗(yàn)從預(yù)防角度出發(fā),采用RNA干擾技術(shù),用靶向PPARγ基因的小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)腺病毒載體轉(zhuǎn)染家兔MSCs,同時(shí)給予細(xì)胞地塞米松,觀察其對(duì)PPARγmRNA和成骨特異性轉(zhuǎn)錄激活因子--核心結(jié)合因子a1(Core binding factor alpha1,Cbfa1)mRNA表達(dá)的影響,探討靶向PPARγ基因RNA干擾保持MSCs成骨分化的作用。

4、r>　　方法:選用家兔第2代骨髓基質(zhì)細(xì)胞,隨機(jī)分為7組,對(duì)照組(C):單純的MSCs,不加特殊處理;模型組(M):加地塞米松使其終濃度為10-7mol/L(以下地塞米松終濃度均為10-7mol/L);感染空載體組(O):加空載體腺病毒1×105IU和地塞米松;感染無關(guān)序列siRNA組(N):加無關(guān)序列siRNA腺病毒1×105IU和地塞米松;干擾1、2、3組(I1、I2、I3):分別給予靶向PPARγ的3種siRNA腺病毒1×105IU

5、和地塞米松。培養(yǎng)7天后采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)7組細(xì)胞中PPARγmRNA及Cbfa1 mRNA的表達(dá)。培養(yǎng)14天后測(cè)定各組成骨指標(biāo):培養(yǎng)液中骨鈣素(osteocalcin,OC)含量,細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。
　　結(jié)果:1.與對(duì)照組比較,模型組、感染無關(guān)序列組及感染空載體組細(xì)胞內(nèi)PPARγmRNA表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而3個(gè)siRNA腺病毒干擾組細(xì)胞內(nèi)P

6、PARγmRNA的表達(dá)降低,均接近于對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.與對(duì)照組比較,模型組、感染無關(guān)序列組及感染空載體組細(xì)胞內(nèi)Cbfa1mRNA表達(dá)、ALP活性、培養(yǎng)液中OC含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而3個(gè)siRNA腺病毒干擾組細(xì)胞內(nèi)Cbfa1mRNA的表達(dá)、ALP活性、培養(yǎng)液中OC含量均明顯增高,均接近于對(duì)照組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　小結(jié):1.激素可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PPAR

7、γmRNA的高表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)Cbfa1mRNA的表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)ALP活性和培養(yǎng)液中OC含量。2.靶向PPARγ基因的siRNA腺病毒載體轉(zhuǎn)染家兔MSCs后,能夠阻斷激素作用而下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PPARγ基因表達(dá),上調(diào)其Cbfa1基因表達(dá),使ALP活性和OC含量處于正常水平,保持細(xì)胞的正常成骨分化。表明靶向PPARγ基因的siRNA重組腺病毒的干擾作用強(qiáng)大,可阻斷激素抑制家兔MSCs成骨分化的作用,為深入研究防治激素性骨壞死提供了可靠的科學(xué)依