沖擊波對體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形成及骨吸收作用的影響.pdf

1、目的:骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)是一種由于骨形成和骨吸收的負(fù)相平衡導(dǎo)致骨骼脆弱,并增加了骨折風(fēng)險為特征的疾病。骨質(zhì)疏松癥與破骨細(xì)胞(osteoclast)數(shù)量和骨吸收活性的增強(qiáng)有密切聯(lián)系。破骨細(xì)胞來源于骨髓單核/巨噬細(xì)胞系,由破骨細(xì)胞前體的融合而來,形成多核巨細(xì)胞,是人體生理性骨重建和病理性骨破壞過程中高度特異性的唯一具有骨質(zhì)吸收功能的多核巨細(xì)胞。骨吸收作用是通過破骨細(xì)胞的活動完成的,因此,破骨細(xì)胞在骨骼的形成和骨量的調(diào)節(jié)方

2、面起著關(guān)鍵作用。病理條件下,許多骨代謝性疾病(如骨質(zhì)疏松癥),都是由于骨吸收亢進(jìn)引起的。因此,對破骨細(xì)胞的形成和骨吸收作用的研究在治療骨質(zhì)疏松等骨吸收疾病中具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 體外沖擊波療法(Extracorporeal Shock Wave Therapy,ESWT)是近20年來發(fā)展起來的一種由體外震波碎石術(shù)衍生來的物理治療方法,二十世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)沖擊波可以治療骨科的很多疾病.實驗研究發(fā)現(xiàn)適宜能量的沖擊波可以增加成

3、骨細(xì)胞的成骨活性,進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。但沖擊波作為一種能量刺激形式,對破骨細(xì)胞的形成及骨吸收活性的影響,目前未見國內(nèi)外有相關(guān)研究。
　　 本實驗通過將體外沖擊波作用于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞,探討沖擊波對破骨細(xì)胞形成及骨吸收作用的影響。
　　 方法:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及誘導(dǎo)培養(yǎng)
　　 密度梯度離心法體外分離骨質(zhì)疏松癥患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,接種在放有蓋玻片和骨片的24孔板中,以1,25-(OH)2D3體外誘導(dǎo)培養(yǎng)

4、,隨機(jī)分為2組,沖擊波干預(yù)組和空白對照組。
　　 2.沖擊波對體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形成的影響
　　 沖擊波干預(yù)組在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4天給予0.08mJ/mm2,100次的沖擊波作用。兩組分別在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3,6,9,12天,提取破骨細(xì)胞,進(jìn)行TRAP染色,進(jìn)行破骨細(xì)胞形態(tài)觀察,進(jìn)行破骨樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞計數(shù),RT-PCR技術(shù)結(jié)合光密度相對值半定量分析不同時間點兩組NFATcl和c—Fos的基因表達(dá)的差異,分析沖擊波對

5、體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形成的影響。
　　 3.體外沖擊波對成熟破骨細(xì)胞骨吸收作用的影響
　　 在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的第12天給予沖擊波干預(yù)組0.08mJ/mm2,100次的沖擊波作用。在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的第15天取出骨片,1％甲苯胺藍(lán)染色后光鏡下進(jìn)行骨陷窩計數(shù),掃描電鏡觀察破骨細(xì)胞形成的骨吸收陷窩,用Image pro plus5.0計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析吸收陷窩的面積,反映破骨細(xì)胞的骨吸收活性。
　　 4.各實驗分別重復(fù)

6、3-5次,實驗數(shù)據(jù)用(x)±s表示,所有參數(shù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。不同時間點沖擊波干預(yù)組和空白對照組均數(shù)比較采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析；2組間破骨細(xì)胞骨吸收陷窩的數(shù)量和面積之間均數(shù)比較采用兩獨立樣本比較的t檢驗,p<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.兩組培養(yǎng)板中TRAP+細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn),破骨樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞計數(shù)顯示兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。沖擊波干預(yù)組在細(xì)胞培養(yǎng)的第4

7、天給予沖擊波干預(yù)(0.08mJ/mm2,100次)后,分別于細(xì)胞培養(yǎng)的第6、9、12天進(jìn)行破骨樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞計數(shù),發(fā)現(xiàn):第6天開始,空白對照組有大量TRAP+細(xì)胞大量出現(xiàn),并出現(xiàn)較多雙核破骨樣細(xì)胞,和散在三核破骨細(xì)胞；沖擊波干預(yù)組中也出現(xiàn)少量雙核破骨細(xì)胞,與空白對照組相比,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),未見三核破骨細(xì)胞。第9天開始,空白對照組有大量雙核破骨細(xì)胞出現(xiàn),并出現(xiàn)較多三核破骨細(xì)胞。沖擊波干預(yù)組中,雙核破骨細(xì)胞僅少量增加

8、,與空白對照組相比其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),三核破骨細(xì)胞散在出現(xiàn),與空白對照組相比其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第12天開始,空白對照組中出現(xiàn)大量典型的多核破骨細(xì)胞,沖擊波干預(yù)組中形成的雙核破骨樣細(xì)胞和三核破骨細(xì)胞數(shù)量均低于空白對照組,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PCR顯示:沖擊波干預(yù)組和空白對照組分別在第3天檢測到c-Fos和NFATcl的表達(dá)。且后期表達(dá)均逐漸增強(qiáng),兩組之間相比較:除第3天兩組無顯著性差異(p

9、>0.05),其余時間點,沖擊波干預(yù)組和空白對照組均有顯著性差異(p<0.05),沖擊波干預(yù)組各時間點的光密度明顯弱于空白對照組。
　　 2.通過對比沖擊波干預(yù)組和對照組骨磨片吸收陷窩的數(shù)量和面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn),沖擊波干預(yù)組的吸收陷窩數(shù)量和面積均小于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示體外沖擊波能抑制破骨細(xì)胞骨吸收作用。
　　 結(jié)論:1.適當(dāng)能量的體外沖擊波能夠抑制體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞形成。破骨細(xì)胞分化過程中