小兒腦性癱瘓的臨床與分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、第一部分：腦性癱瘓的臨床特征與發(fā)病相關(guān)因素分析
　　目的：分析腦癱的臨床特征并探討影響腦癱發(fā)病的相關(guān)因素。
　　方法：選擇2008年5月至2009年10月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦癱康復(fù)治療中心、鄭州市兒童醫(yī)院腦癱科和河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腦癱科的住院腦癱病人374例。回顧性分析腦癱的臨床特征及可能的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果：1.性別和就診年齡:374例腦癱中,男性245例(65％％),女性129例(35％),男性患兒明顯

2、多于女性,男女之比為:1.9:1。就診年齡最小為3月,最大為120月,平均16.90±12.62月。就診年齡在0～3月、～6月、～12月、～24月、～48月和＞48月的患兒分別占全組病例的0％、17％、30％、29％、18％和6％。2.出生胎齡分布:出生胎齡＜30wks、～32wks、～34wks、～37wks和≥37wks的患兒分別占全組病例的6％、5％、7％、13％、69％。在腦癱的出生胎齡構(gòu)成中以足月兒為主。3.出生體重分布:出生

3、體重＜1000g、～1500g、～2500g、～4000g和≥4000g的患兒分別占全組病例的0％、2％、22％、75％、1％。在腦癱的出生體重構(gòu)成中以2500g-4000g為主。4.臨床類型:痙攣型最多211例(56％),其次為混合型47例(13％)、肌張力低下型45例(12％)、共濟(jì)失調(diào)型30例(8％)、不隨意運(yùn)動(dòng)型24例(6％)和分類不明17例(5％)。5.影像學(xué)表現(xiàn):158例有影像學(xué)資料(CT/MRI),其中有陽性發(fā)現(xiàn)者119例

4、,陽性率64.32％。腦室周圍白質(zhì)軟化最多見為34例(28.57％,),其次為大腦發(fā)育不全33例(27.73％),外部性腦積水24例(20.17％),先天性腦發(fā)育異常14例(11.76％),側(cè)腦室擴(kuò)大12例(10.08％),皮層萎縮2例(1.68％)。6.合并癥:在374例腦癱中有合并癥者170例(45.45％),其中最常見的是智力低下(29.7％)。7.發(fā)病危險(xiǎn)因素:在374例腦癱中,133例(占35.6％)有與腦癱發(fā)病的相關(guān)危險(xiǎn)因素

5、,新生兒缺氧缺血性腦病41.35％,早產(chǎn)28.57％,出生窒息7.54％為前三位原因。241例(64.4％)未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論：在已知的危險(xiǎn)因素中,圍產(chǎn)期缺氧缺血和早產(chǎn)是腦癱發(fā)病的主要相關(guān)因素,然而尚有64.4％的病例沒有發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)因素。提示我們不僅要進(jìn)一步提高圍產(chǎn)保健和新生兒復(fù)蘇技術(shù)以降低腦癱的發(fā)病率,而且須進(jìn)一步探討腦癱的其他危險(xiǎn)因素。
　　第二部分：MTHFR基因多態(tài)性與腦性癱瘓的關(guān)聯(lián)性
　　目的：

6、探討亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與腦性癱瘓的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：1.選擇2008年5月至2009年10月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦癱康復(fù)治療中心、鄭州市兒童醫(yī)院腦癱科和河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腦癱科的住院腦癱病人159例(女50例,男109例,平均年齡16.9±14.4月)及同時(shí)期在其年齡和性別相匹配的來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒童保健科健康體檢的正常兒童169例((女64例,男105例,平均年齡16.4±13.8月)。2.采用酚氯

7、仿法從靜脈血提取DNA,采用TaqManTM基因分型技術(shù)對(duì)所選取的MTHFR基因的5個(gè)SNPs(rs4846049、rs1476413、rs1801131、rs1801133和rS9651118)進(jìn)行基因分型,然后采用在線軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè),并比較兩組單個(gè)位點(diǎn)等位基因和基因型頻率,采用SNPSpD軟件進(jìn)行多重檢驗(yàn)以及Haploview軟件進(jìn)行單倍型

8、的分析,最后進(jìn)行邦弗尼校正。
　　結(jié)果：1.Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn):所有5個(gè)SNPs(rs4846049,rs1476413,rs1801131,rs1801133,rs9651118)的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡(p＞0.05)。2.關(guān)聯(lián)分析:所有5個(gè)SNPs的基因型及等位基因型頻率在腦癱和正常對(duì)照之間沒有顯著差異(p＞0.05)。進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn),在腦癱合并智力低下組和正常對(duì)照之間,3

9、個(gè)SNPs(rs4846049、rs1476413和rs1801131)的基因型及等位基因型頻率存在顯著差異(rs4846049,p=0.031;rs1476413,p=0.028;rs1801131p=0.014,p值均為SNPSpD校正后)。腦癱合并智力低下組rs2433322T等位基因頻率、rs1476413T等位基因頻率和rs1801131G等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照。用5個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)建單倍型,在單倍型分析中,發(fā)現(xiàn)單倍型T

10、TGGT與腦癱并智力低下有明顯的關(guān)聯(lián)性(p=0.001,OR=2.695,95％CI=1.470-4.941,p=0.005,邦弗尼校正后)。在出生胎齡小于37周腦癱組、出生體重小于2500g腦癱組、出生窒息腦癱組和正常對(duì)照之間,所有5個(gè)SNPs的基因型及等位基因型頻率沒有顯著差異(p均＞0.05)。
　　結(jié)論：我們的研究結(jié)果并不支持MTHFR基因的5個(gè)SNPs在中國(guó)漢族人群與腦癱相關(guān)聯(lián)。但我們發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs與腦癱合并智力低下有

11、關(guān)聯(lián),因此,MTHFR基因多態(tài)性可能是腦癱合并智力低下的相關(guān)危險(xiǎn)因素。
　　第三部分：AP4M1基因多態(tài)性與腦性癱瘓的關(guān)聯(lián)性
　　目的：探討AP4M1基因多態(tài)性與腦性癱瘓的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：1.選擇2008年5月至2009年10月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦癱康復(fù)治療中心、鄭州市兒童醫(yī)院腦癱科和河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腦癱科的住院腦癱病人159例(女50例,男109例,平均年齡16.9±14.4月)及同時(shí)期在其年齡和性別

12、相匹配的來自鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒童保健科健康體檢的正常兒童169例((女64例,男105例,平均年齡16.4±13.8月)。2.采用酚氯仿法從靜脈血提取DNA,采用TaqManTM基因分型技術(shù)對(duì)所選取的AP4M1基因的4個(gè)SNPs(rs1534310、rs4729577、rs2293479和rs13309)進(jìn)行基因分型,然后采用在線軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡

13、檢測(cè),并比較兩組單個(gè)位點(diǎn)等位基因和基因型頻率,采用SNPSpD軟件進(jìn)行多重檢驗(yàn)以及Haploview軟件進(jìn)行單倍型的分析,最后進(jìn)行邦弗尼校正。
　　結(jié)果：1.Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn):所有4個(gè)SNPs(rs1534310、rs4729577、rs2293479和rs13309)的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡(p＞0.05)。2.關(guān)聯(lián)分析:所有4個(gè)SNPs的基因型及等位基因型頻率在腦癱和正常對(duì)照之間沒

14、有顯著差異(p＞0.05)。我們用4個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)建單倍型,在單倍型分析中,沒有發(fā)現(xiàn)單倍型ACCT、ACTT、ATCA、ATTA和TCTT與腦癱的關(guān)聯(lián)性(p=0.410)。進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析:所有4個(gè)SNPs的基因型及等位基因型頻率在腦癱并智力低下組、出生胎齡小于37周腦癱組、出生體重小于2500g腦癱組、出生窒息腦癱組與對(duì)照組之間沒有顯著差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論：我們的研究發(fā)現(xiàn)AP4M1基因多態(tài)性在中國(guó)漢族人群與腦癱無

15、關(guān)聯(lián)。
　　第四部分：同卵雙生子腦癱患兒全基因組DNA甲基化的研究
　　目的：探討DNA甲基化對(duì)同卵雙生子腦性癱瘓的影響。
　　方法：研究對(duì)象:鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院腦癱康復(fù)治療中心住院的2對(duì)雙生子(均為一個(gè)是腦癱患兒,一個(gè)是正常兒)作為研究對(duì)象。TwinpairⅠ:男,14月,1號(hào)(序號(hào))為痙攣型雙癱,2號(hào)為正常兒;TwinpairⅡ:男,31月,5號(hào)為正常兒,6號(hào)為痙攣型四肢癱。采用酚氯仿法從靜脈血提取DNA,微衛(wèi)星

16、DNA基因分型技術(shù)進(jìn)行雙生子卵性鑒定。采用MBD親和柱層析富集DNA甲基化片斷,繼而進(jìn)行Solexa測(cè)序/生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：1.卵形鑒定:9個(gè)STR在每對(duì)雙生子間的基因型完全一致,因此判定均為同卵雙生子。2.DNA高甲基化區(qū)域:發(fā)現(xiàn)每對(duì)雙生子腦癱和正常兒間存在不同的:DNA高甲基化區(qū)域,通過比較每對(duì)腦癱和正常兒間DNA甲基化狀態(tài)不同的片段,發(fā)現(xiàn)腦癱特異性的高甲基化區(qū)域分別為:1號(hào):25440個(gè);6號(hào):103885個(gè);正常

17、兒高甲基化區(qū)域分別為:2號(hào):38772個(gè);5號(hào):3622個(gè)。將兩例腦癱或正常兒的高甲基化區(qū)域進(jìn)行比較,我們發(fā)現(xiàn)腦癱共同甲基化的區(qū)域有10679個(gè),而正常兒共同甲基化的區(qū)域?yàn)?26個(gè)。選擇出腦癱共同甲基化的區(qū)域和正常兒共同甲基化的區(qū)域的蛋白編碼基因的啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)前者有661個(gè),后者有41個(gè)。
　　結(jié)論：我們采用全基因組DNA甲基化分析技術(shù)對(duì)兩對(duì)同卵雙生子的腦癱和正常兒的血細(xì)胞進(jìn)行了分析,選擇出了腦癱共同甲基化的的啟動(dòng)子區(qū)域的蛋白編碼