線粒體氧化應(yīng)激在糖尿病大鼠骨骼肌病變機(jī)制中的作用.pdf

1、目的： 1．探討線粒體氧化應(yīng)激在糖尿病骨骼肌病變中的作用。 2．探討解偶聯(lián)蛋白UCP-3在線粒體氧化應(yīng)激中的調(diào)節(jié)作用。 3．探討線粒體氧化應(yīng)激加重胰島素抵抗的機(jī)制。 4．探討抗氧化劑α-硫辛酸(α-LA)的干預(yù)效果及干預(yù)機(jī)制。 方法： 一．1型糖尿病大鼠的干預(yù)治療 1．一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(45mg/kg體重)制備糖尿病大鼠模型。

2、 2．將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：正常對(duì)照組、糖尿病組、胰島素治療組、糖尿病α-LA干預(yù)組(硫辛酸組)，每組又分三個(gè)階段處死(4周、8周、12周)。 胰島素組每天皮下注射PZI (6U/Kg體重)，硫辛酸組每天腹腔注射α-LA(100 mg/kg體重)。 3．血生化指標(biāo)的測(cè)定：測(cè)定各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、血脂和血游離脂肪酸。 4．HE、Masson染色觀察各組大鼠骨骼肌的病理變化。 5．透射電鏡檢測(cè)骨骼肌超

3、微病理改變。 6．差速離心法提取骨骼肌組織的線粒體，應(yīng)用TBA( thiobarbituric acid)法測(cè)量線粒體中丙二醛(Maleic Dialdehyde，MDA) 含量，比色法測(cè)量線粒體中錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性及還原型谷胱甘肽(GSH)含量。 7．利用免疫組化技術(shù)測(cè)量骨骼肌組織中半胱天冬酶-3、Bcl-2/Bax表達(dá)的變化。 8．利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(SQ-

4、RT-PCR)、Western 印跡技術(shù)檢測(cè)線粒體中Mn-SOD和UCP3的表達(dá)水平。 二．2型糖尿病大鼠的干預(yù)治療 1．高脂飲食和高脂飲食加尾靜脈注射小劑量鏈脲佐菌素(30 mg/kg體重)制備高脂和2型糖尿病大鼠模型。 2．將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：正常對(duì)照組、高脂組、2型糖尿病組、2型糖尿病干預(yù)組(硫辛酸組)。 3．檢測(cè)血漿中胰島素水平、毛細(xì)血管法測(cè)定胰島素敏感性。 4.利用免疫組化技術(shù)測(cè)量骨骼肌

5、組織中GLUT-4的表達(dá)。 5.每次處死動(dòng)物前在麻醉狀態(tài)下頸動(dòng)脈插管測(cè)量大鼠主動(dòng)脈收縮血壓(SBP)和舒張壓(DBP)。其余檢測(cè)指標(biāo)同1型糖尿病大鼠。 結(jié)果： 一.1型糖尿病大鼠 1.STZ制備糖尿病大鼠模型成功率86.4％。 2.一般情況的比較：糖尿病組、胰島素組、硫辛酸組大鼠的體重低于對(duì)照組，而血糖、糖化血紅蛋白高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；糖尿病組和硫辛酸組血糖、糖化血紅蛋白

6、、體重差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，胰島素組血糖、糖化血紅蛋白明顯低于糖尿病組、硫辛酸組(P<0.01)，體重明顯高于后兩組(P<0.01)，幾組間血脂、游離脂肪酸差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.線粒體氧化應(yīng)激結(jié)果：正常對(duì)照組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)無(wú)改變，糖尿病組GSH的含量隨病程進(jìn)展逐漸下降，Mn-SOD活性和cAT活性在4周時(shí)無(wú)變化， 8周、12周時(shí)下降，而MDA的含量隨病程進(jìn)展逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

7、5)。與糖尿病組比較，應(yīng)用CLA和胰島素干預(yù)均可使同期的GSH含量、CAT活性和Mn-SOD的活性上升，MDA含量下降，胰島素組改變更為明顯。 4.病理結(jié)果：與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠可見普遍性肌萎縮，肌纖維排列紊亂，肌間隙增寬，超微病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖尿病組4周時(shí)出現(xiàn)線粒體數(shù)量增多、腫脹等代償表現(xiàn)，隨病程進(jìn)展，線粒體嵴斷裂或溶解，線粒體髓樣化，出現(xiàn)局灶性肌絲溶解，Z盤變形及模糊不清，肌細(xì)胞核異染色質(zhì)增多，肌細(xì)胞膜呈鋸齒狀突起，肌纖

8、維問的微血管管腔變窄，內(nèi)膜明顯突起，基底膜增厚等表現(xiàn)。Masson染色顯示骨骼肌膠原組織含量隨病程延長(zhǎng)明顯增加，α-LA干預(yù)可以改善上述結(jié)構(gòu)的紊亂，胰島素治療組無(wú)明顯肌萎縮。 5.Bcl-2/Bax和cas-3表達(dá)的變化：與對(duì)照組比較，糖尿病組Bcl-2表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)隨病程逐漸增加，Bcl-2/Bax逐漸降低，cas-3表達(dá)隨病程逐漸增加，胰島素和α-LA干預(yù)可在一定程度上減弱這種改變，上述變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、 6.Mn-SOD和UCP3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化：與對(duì)照組比較，4周時(shí)糖尿病組Mn-SOD和UCP3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)稍高于正常對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8周、12周時(shí)表達(dá)明顯下降(P<0.05)，胰島素和α-LA干預(yù)可在一定程度上提高M(jìn)n-SOD和UCP3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05)。 二.2型糖尿病大鼠 1.2型糖尿病病大鼠模型成功率73.3％。 2.一般情況的比較：高脂喂養(yǎng)4周后，大鼠

10、體重、TG、TC、FINS、FFA、HOMA-IR明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，KITT明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，血糖有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射STZ后，與對(duì)照組相比，糖尿病組血糖升高，體重下降，TG、TC、FFA、HOMA-IR、SBP、DBP水平明顯高于其他三組(P<0.05)，KITT明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，硫辛酸組干預(yù)后上述指標(biāo)明顯改善。高脂組各項(xiàng)指標(biāo)介于糖尿病組和對(duì)照組之間。 3.

11、線粒體氧化應(yīng)激結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，高脂組和2型糖尿病組GSH的含量、Mn-SOD活性和CAT活性下降，而MDA的含量增加，糖尿病組上述指標(biāo)變化更明顯(P<0.05)。2型糖尿病大鼠應(yīng)用α-LA干預(yù)后可使GSH 含量、CAT 活性和 Mn-SOD 的活性上升，MDA 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4.病理結(jié)果：與對(duì)照組比較，2型糖尿病組大鼠可見輕度肌萎縮，光鏡和電鏡下均可見脂肪浸潤(rùn)，在肌纖維間和肌纖維內(nèi)部均見比

12、較明顯的脂肪變性，在一些肌纖維橫斷面上，可見肌纖維內(nèi)部的大部分空間被脂肪滴所占據(jù)。α-LA干預(yù)可以改善上述結(jié)構(gòu)的紊亂。 5.Bcl-2/Bax和cas-3表達(dá)的變化：與對(duì)照組比較，糖尿病組Bcl-2表達(dá)有下降的趨勢(shì)，Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax降低，cas-3表達(dá)也有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；α-LA干預(yù)可在一定程度上減弱這種改變，高脂組上述指標(biāo)變化不明顯。 6.GLUT-4蛋白表達(dá)的改變：糖尿

13、病組GLUT-4表達(dá)低于正常對(duì)照組，α-LA干預(yù)后可以提高GLUT-4蛋白表達(dá) (P<0.05)，高脂組與正常對(duì)照相比，GLUT-4表達(dá)有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.1型糖尿病狀態(tài)下，骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激損傷明顯增加，誘發(fā)肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致普遍性萎縮。 2.2型糖尿病狀態(tài)下，骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激加重胰島素抵抗，胰島素抵抗進(jìn)一步加重骨骼肌病變。 3.抗氧化劑能夠通過增加抗氧化酶如M