端粒酶催化亞單位(hTERT)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:端粒酶異常高表達(dá)與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，而其催化亞單位（hTERT）是合成端粒酶全酶的限速因素。已有的研究表明，端粒酶的活性受到抑制后能夠引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力下降，并伴有細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。目前一些學(xué)者認(rèn)為端粒酶對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用不僅與端粒酶能夠維持端粒的穩(wěn)定性有關(guān)，很可能也通過(guò)非端粒依賴的方式進(jìn)行。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RNA干擾技術(shù)由于其特異性和高效性而廣泛應(yīng)用于基因功能及腫瘤的基因治療等方面研究，顯示出巨大的

2、應(yīng)用前景。本研究設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了針對(duì)hTERT的siRNA，通過(guò)其對(duì)hTERT表達(dá)的特異性抑制作用，觀察對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及能否引起非端粒依賴性的細(xì)胞凋亡。并利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)與這種凋亡相關(guān)的基因表達(dá)變化及microRNA表達(dá)的變化。以期為深入理解hTERT的作用機(jī)理提供有價(jià)值的信息。 方法:設(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對(duì)hTERT的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入HeLa細(xì)胞內(nèi)，然后應(yīng)用半定量RT-PCR、Western blot

3、ting、實(shí)時(shí)定量TRAP的方法檢測(cè)hTERI-siRNA對(duì)hTERT表達(dá)的抑制效率及對(duì)端粒酶活性的抑制效率。然后通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及荷瘤裸鼠的siRNA腫瘤內(nèi)注射的方法檢驗(yàn)hTERT-siRNA能否抑制HeLa細(xì)胞的體外增殖能力及體內(nèi)的生長(zhǎng)能力。接著利用TUNEL，原位凋亡檢測(cè)的方法檢驗(yàn)hTERT-siRNA能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。利用基因芯片檢測(cè)hTERT-siRNA引起的基因表達(dá)及microRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果:在

4、第一部分中，半定量RT-PCR結(jié)果示，hTERT-siRNA組細(xì)胞hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0．20，顯著小于β-gal-siRNA組的0．73及LipofectAmine only組的0．78。Western blotting結(jié)果顯示hTERT-siRNA組hTERT·myc融合蛋白的表達(dá)水平明顯低于兩個(gè)對(duì)照組。實(shí)時(shí)定量TRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hTERT-siRNA組端粒酶的活性僅為兩個(gè)對(duì)照組的38％。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明所設(shè)計(jì)的h

5、TERT-siRNA可以特異、有效地抑制HeLa細(xì)胞中hTERT的mRNA及蛋白表達(dá)水平，并降低端粒酶的活性。在第二部分中，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，hTERT-siRNA組的克隆形成數(shù)量為1．00±1．00，明顯小于β-gal-siRNA組的4．33±0．58和LipofectAmineonly組的4．00±1．00。荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)注射siRNA治療實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)hTERT-siRNA組的腫瘤體積為940．12±244．2mm

6、3小于β-gal-siRNA組的2137．9±403．72mm3和LipofectAmine only組的1896．92±291．23mm3，hTERT-siRNA組的腫瘤重量0．71±0．23g小于β-gal-siRNA組的1．46±0．32g和LipofectAmine only組的1．34±0．23g。說(shuō)明hTERT-siRNA能夠明顯抑制的體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。在第三部分中，TUNEL原位凋亡檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，hTE

7、RT-siRNA組凋亡率為86．9％±3．5％，明顯高于β-gal-siRNA組的2．6％±2．3％和LipofectAmine only組的9．0％±2．3％，提示hTERT-siRNA可以誘導(dǎo)某種非端粒依賴性的凋亡?；蛐酒慕Y(jié)果顯示hTERT-siRNA組和對(duì)照組之間有54個(gè)基因的表達(dá)差異大于4倍，其中16個(gè)與細(xì)胞的凋亡過(guò)程可能相關(guān)，應(yīng)用半定量RT-PcR的方法驗(yàn)證了其中的6個(gè)。microRNA芯片篩選出18個(gè)在hTERT-siR

8、NA組表達(dá)而β-gal-siRNA組未表達(dá)的microRNA，1個(gè)在β-gal-siRNA組表達(dá)而hTERT-siRNA組未表達(dá)的microRNA，其中1et-7a-2、let-7a-3、let-7e、let-7i的變化可能與hTERT-siRNA誘導(dǎo)凋亡的表型變化相關(guān)。 結(jié)論:hTERT能夠通過(guò)某種非端粒依賴性的方式抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，hTERT特異性的siRNA可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其生長(zhǎng)。通過(guò)cDNA芯片和microRN