MLCK在失血性休克大鼠淋巴管收縮性與血管反應性變化中的作用及其機制.pdf

1、背景：肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase， MLCK)是決定淋巴管與血管收縮和舒張的關鍵酶。研究表明，失血性休克(hemorrhagic shock， HS)發(fā)展進程中存在淋巴微循環(huán)障礙，淋巴管收縮功能與休克的發(fā)展密切相關，休克不同時相的淋巴管收縮性表現(xiàn)為雙相變化，即休克早期淋巴管收縮性增強、重癥休克期淋巴管收縮性降低，MLCK是否參與休克淋巴管收縮性的雙相調(diào)節(jié)，未見報道。同時發(fā)現(xiàn)，休克腸淋巴液回流是導

2、致血管低反應性的重要因素，結(jié)扎腸系膜淋巴管或腸淋巴液引流均可提高休克大鼠的血管反應性與鈣敏感性，MLCK是否參與休克腸淋巴液介導血管低反應性的分子機制，值得研究。
　　 目的：本研究復制HS模型，針對休克淋巴管收縮性的雙相變化，采用離體淋巴管灌流技術，應用MLCK工具藥，觀察MLCK對離體淋巴管泵活性的影響，探討MLCK在休克離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用機制，為休克淋巴管收縮性的調(diào)控提供實驗依據(jù)；針對休克腸淋巴液對降低血管反

3、應性的作用，采用離體血管張力測定技術，應用MLCK工具藥，觀察MLCK對休克大鼠血管反應性與鈣敏感性的影響，探討MLCK在休克腸淋巴液介導血管低反應性與鈣失敏的作用機制，以腸淋巴途徑為切入點，為休克血管低反應性的臨床干預提供實驗依據(jù)與理論參考。
　　 方法與結(jié)果：
　　 第一部分、 MLCK在失血性休克大鼠離體淋巴管收縮性雙相變化中的作用及其機制
　　 方法：Wistar雄性大鼠隨機均分為對照組、Shock組（復

4、制HS模型，分為休克0h、0.5h、1h、2h、3h亞組），所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉肌肉注射麻醉后，行股部手術，右股靜脈注射肝素鈉全身抗凝，右股動脈插管連接生物信號采集系統(tǒng)，連續(xù)監(jiān)測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP);左側(cè)股動脈插管后連接注射器固定于抽注機上備放血用。待所有手術完成、穩(wěn)定30min后，休克組大鼠經(jīng)左股動脈勻速放血，10min內(nèi)將MAP降至40mmHg，復制失血性休克模型。對照組大鼠進行相同的手術

5、操作，但不放血。在對照組完成手術后30min、休克各組在相應時間點，留取胸導管組織，用于Western blot法檢測MLCK蛋白表達；利用離體淋巴管分離技術，在對照組完成手術穩(wěn)定30min后、休克大鼠各時間點，分離胸導管，手術顯微鏡下分離干凈胸導管周圍組織，制備離體淋巴管，移入微血管壓力-直徑測定儀的浴槽內(nèi)、固定、孵育，待淋巴管出現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)性收縮后，觀察淋巴管在不同跨壁壓(1cmH2O、3cmH2O、5cmH2O)下的收縮頻率（co

6、ntraction frequency， CF）、收縮末期口徑(end systolic diameters， ESD)、舒張末期口徑(end diastolic diameters， EDD)、被動管徑(passive(relaxed) diameters， PD)的變化，根據(jù)檢測的淋巴管各口徑和頻率，以緊張指數(shù)(tonic index， TI)、收縮幅度(contraction amplitude， CA)、泵流分數(shù)（fractio

7、nal pump flow， FPF）等指標，結(jié)合CF作為評價淋巴管活性的指標。其中：TI=(PD-EDD)/PD×100％;CA=(EDD-ESD)/PD×100％;FPF=(EDD2-ESD2)/EDD2×CF。同時另取shock0.5h與2h組大鼠的淋巴管條，分別與MLCK抑制劑ML-7、激動劑P物質(zhì)( SP)單獨或共同孵育(具體分組為：shock0.5h+ML-7、shock0.5h+ML-7+SP、shock2h+SP、sho

8、ck2h+SP+ML-7)，觀察MLCK在休克淋巴管收縮性雙相變化中的作用。
　　 結(jié)果：Shock0h和0.5h淋巴管組織MLCK蛋白顯著高于對照組；隨著休克發(fā)展，MLCK蛋白表達逐漸降低。在1、3、5cmH2O等多個跨壁壓下，shock0.5h組淋巴管的CF、TI、FPF均顯著高于對照組，ML-7可顯著下調(diào)這些指標，SP則可明顯降低ML-7的作用，使之恢復至shock0.5h水平；shock2h組淋巴管的CF、TI、FPF均

9、顯著低于對照組，SP可顯著上調(diào)這些指標，ML-7則可顯著降低SP的作用。shock0.5h與2h離體淋巴管CA與對照組相比無顯著變化，SP可降低shock2h淋巴管的CA、ML-7可抑制該作用，但二者對shock0.5h無明顯作用。結(jié)果表明，MLCK作為影響淋巴管平滑肌細胞收縮的關鍵酶，參與了HS發(fā)展進程中淋巴管收縮性的雙相調(diào)節(jié)。
　　 第二部分 MLCK在休克腸淋巴液介導大鼠血管低反應性中的作用及其機制
　　 方法：2

10、4只Wistar雄性大鼠隨機均分為假手術組(Sham)、休克組(Shock)、休克腸淋巴液引流1組(shock mesenteric lymph drainage from shock0h， shock+drainage0-3h)、休克腸淋巴液引流2組(shock mesenteric lymph drainage from shock1h， shock+drainage1-3h)，所有動物均行股部手術用于復制HS模型、腹部手術用于腸系

11、膜淋巴管剝離，其中shock+drainage0-3h與shock+drainage1-3h組大鼠行腸系膜淋巴管插管，分別于休克0h、1h引流休克腸淋巴液至休克3h。待所有手術完成、穩(wěn)定30min后，休克組與引流組大鼠按前述方法復制動物模型；假手術組進行相同的手術操作，但不放血。休克組、兩個引流組在維持低血壓3h后、假手術組在相應時間點，留取腸系膜上動脈(superior mesenteric artery， SMA)，每根SMA制備2

12、條血管環(huán)，一條用于血管反應性觀察，另一條用于鈣敏感性測定。另取12只大鼠，作為shock組與shock+drainage1-3h組(n=6)，每只動物制備2根血管環(huán)，shock組血管環(huán)和休克組大鼠的血管環(huán)分別與MLCK激動劑SP孵育、shock+drainage1-3h組大鼠的血管環(huán)與MLCK抑制劑ML-7孵育后，進行血管反應性與鈣敏感性測定，評價MLCK在休克腸淋巴液介導大鼠血管低反應性中的作用。
　　 結(jié)果：Shock3h組

13、大鼠的血管環(huán)對各濃度NE、shock+drainage0-3h組大鼠的血管環(huán)對NE(自10-8mol/L起)的收縮反應性均顯著低于sham組，shock+drainage1-3h組大鼠的血管環(huán)對各濃度NE的收縮反應性與sham組均無統(tǒng)計學意義；shock+drainage0-3h組自NE濃度10-6mol/L起、shock+drainage1-3h組自10-8mol/L起均顯著高于shock3h組；且shock+drainage1-3h

14、組自10-7mol/L起均顯著高于shock+drainage0-3h組。Shock3h組大鼠血管環(huán)對梯度鈣離子（自10-4mol/L起）、shock+drainage0-3h組在10-2mol/L、3×10-3mol/L時的收縮性均顯著低于sham組，shock+drainage1-3h組大鼠的血管環(huán)對各濃度鈣離子的收縮反應性與sham組均無統(tǒng)計學意義；shock+drainage0-3h、shock+drainage1-3h組自10

15、-4mol/L起均顯著高于shock3h組；且shock+drainage1-3h組自10-3mol/L起均顯著高于shock+drainage0-3h組。同時，shock3h對梯度NE與鈣離子Emax、pD2、shock+drainage0-3h組對梯度NE的Emax、pD2以及梯度鈣離子的Emax均分別顯著低于sham組，shock+drainage0-3h、shock+drainage1-3h組血管環(huán)對梯度NE與鈣離子Emax均顯

16、著高于shock3h組，且shock+drainage1-3h組對梯度NE與鈣離子Emax均顯著高于shock+drainage0-3h組。研究結(jié)果表明，自休克1h起引流腸淋巴流可顯著提升大鼠血管反應性與鈣敏感性。進一步應用MLCK激動劑SP與shock3h、抑制劑ML-7與shock+drainage1-3h血管環(huán)孵育后，在NE濃度為10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L時，SP顯著提高了shock3h、ML-7顯

17、著降低了shock+drainage1-3h組的血管反應性；在鈣離子濃度為10-3 mol/L、3×10-3mol/L、10-2mol/L、3×10-2mol/L時，SP提高了shock3h、ML-7顯著降低了shock+drainage1-3h組血管環(huán)的鈣敏感性；兩組大鼠血管環(huán)與工具藥孵育后，NE為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L時的血管反應性、在鈣離子濃度為3×10-5mol/L、10-4mol/L、3×1

18、0-4mol/L時的鈣敏感性，兩組間均無統(tǒng)計學變化。同時，SP顯著提高了shock3h血管環(huán)對梯度NE的Emax、對梯度鈣離子的Emax、pD2、但仍低于sham組，ML-7抑制了shock+drainage1-3h組血管環(huán)對梯度NE與鈣離子的Emax、但仍高于shock3h組。研究結(jié)果提示，MLCK參與了休克腸淋巴液介導血管低反應性、鈣失敏的作用機制。
　　 結(jié)論：MLCK在失血性休克后淋巴管收縮性的雙相變化中發(fā)揮重要作用，以