選擇性細(xì)胞滯留技術(shù)快速構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 因現(xiàn)代戰(zhàn)爭及和平時期交通、建筑等行業(yè)的高能量損傷、骨腫瘤切除、骨結(jié)核與感染等所致的骨缺損日益常見。作為治療骨缺損金標(biāo)準(zhǔn)的自體骨移植，由于存在取骨量有限和取骨區(qū)并發(fā)癥，已不能滿足骨缺損治療的需要。利用骨髓干細(xì)胞與生物材料結(jié)合構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)骨缺損的動物實(shí)驗(yàn)已獲得較為肯定的效果，但其缺點(diǎn)在于MSCs來源少、體外培養(yǎng)擴(kuò)增周期長、細(xì)胞對支架材料的粘附率不足、技術(shù)條件高，從而影響了其在骨缺損治療中的應(yīng)用。自體紅骨髓經(jīng)皮注

2、射在臨床治療骨不連和填充骨缺損等方面已取得一定的成功，但應(yīng)用直接注入的方法，局部干細(xì)胞容易流失，影響了療效。SCR是骨髓干細(xì)胞富集技術(shù)之一，是通過基質(zhì)材料適當(dāng)?shù)木W(wǎng)孔結(jié)構(gòu)和良好的表面粘附性能，使骨髓流經(jīng)時選擇性滯留利于成骨的干細(xì)胞及促成骨因子等成分，所構(gòu)建的TEB即刻回植修復(fù)骨缺損，可獲得與自體骨移植相接近的效果。但由于受到知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和入關(guān)限制的影響，該技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品至今難以在我國臨床應(yīng)用。為此，本實(shí)驗(yàn)主要目的包括：(1)制備一種新型的

3、骨髓干細(xì)胞富集材料，并觀察其體外細(xì)胞相容性和體內(nèi)組織相容性；(2)探討SCR技術(shù)快速構(gòu)建的TEB的異位成骨效果；(3)探討新型富集材料應(yīng)用SCR技術(shù)處理后對骨髓細(xì)胞和促成骨生長因子的富集效果；(4)觀察SCR技術(shù)快速構(gòu)建的TEB對成骨標(biāo)志物和成骨特異性轉(zhuǎn)錄激活因子Cbfα1表達(dá)的影響，探討富集材料促成骨的可能機(jī)制。 方法： (1)采用多聚左旋賴氨酸修飾人脫鈣骨基質(zhì)制備一種新型的骨髓干細(xì)胞富集材料，用液體置換法、掃描電鏡、

4、三維視頻顯微鏡、拉曼光譜、紅外光譜和HE染色測定其密度、孔隙率、孔徑等表面特征； (2)將富集材料和不同濃度的材料浸提液與hMSCs共培養(yǎng)，應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法、流式細(xì)胞儀、免疫組織化學(xué)、溶血實(shí)驗(yàn)等評價材料的體外細(xì)胞相容性； (3)裸鼠分別予腹腔注射PLL-DBM的生理鹽水浸提液、背部皮下注射PLL-DBM浸提液培養(yǎng)后的DOC細(xì)胞懸液、背部植入PLL-DBM材料后，采用全身急性毒性試驗(yàn)、致癌試驗(yàn)和皮下植入試驗(yàn)等評價材

5、料的體內(nèi)組織相容性。 (4)采用SCR技術(shù)使PLL-DBM富集骨髓后快速構(gòu)建TEB，分別將SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB(SCR組)、體外培養(yǎng)的MSCs復(fù)合DBM常規(guī)構(gòu)建的TEB(TEB組)、注射骨髓復(fù)合DBM(骨髓組)、單純DBM(DBM組)植入裸鼠皮下，4、8、12、16w時取材，應(yīng)用X線攝片、CT掃描、掃描電鏡和HE染色等方法，觀察植骨處影像密度、植骨區(qū)組織學(xué)改變和成骨效果； (5)應(yīng)用SCR技術(shù)處理富集材料，觀察富集前后

6、PLL-DBM對骨髓有核細(xì)胞、血小板及纖維母細(xì)胞集落形成單位的富集效果，ELISA法檢測富集前后骨髓上清中TGF-β1和PDGF表達(dá)； (6)采用SCR技術(shù)富集骨髓后快速構(gòu)建TEB，分別將SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB(SCR組)、MSCs復(fù)合DBM常規(guī)構(gòu)建的TEB(TEB組)、注射骨髓復(fù)合DBM(骨髓組)、單純DBM(DBM組)植入裸鼠皮下，應(yīng)用免疫組化和RT-PCR方法，檢測4、8、12、16w時組織塊內(nèi)成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原、整合素α

7、2β1、骨鈣素表達(dá)，及成骨特異性轉(zhuǎn)錄激活因子Cbfα1表達(dá)。 結(jié)果： (1)PLL在材料內(nèi)外表面形成均勻的乳白色涂層。PLL-DBM密度為(0.27±0.02)g/ml，孔隙率為(73±11)％，孔徑為(412.73±160.29)μm?？着c孔之間有約100μm左右小孔貫通，孔隙內(nèi)部有大量孔隙相互連通，并在天然孔隙內(nèi)形成更小、孔徑較均勻的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。 (2)將富集材料及其不同濃度的材料浸提液分別與hMSCs共培養(yǎng)，

8、形態(tài)學(xué)觀察示細(xì)胞生長良好；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示hMSCs均良好增殖，毒性O(shè)-1級；流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)hMSCs、DOC均無DNA倍體異常的細(xì)胞，其CD29、CD105呈陽性，CD34、CD45呈陰性，材料浸提液不影響hMSCs表面分子的表達(dá)，且可通過促其向增殖期轉(zhuǎn)化而促進(jìn)hMSCs增殖；成骨誘導(dǎo)后DOC的生長與成骨活性無異常，可形成鈣結(jié)節(jié)、表達(dá)Ⅰ型膠原，ALP活性未受影響。溶血試驗(yàn)測得溶血率2.617％，符合生物材料要求小于5％的標(biāo)準(zhǔn)。

9、 (3)全身急性毒性試驗(yàn)顯示裸鼠體重正常增長；致癌試驗(yàn)顯示裸鼠正常存活，8月內(nèi)未見腫塊形成，心、肝、腦、肺、腎、脾組織學(xué)觀察未見腫瘤細(xì)胞；皮下植入試驗(yàn)顯示取材后皮下組織緊裹材料表面，色澤無改變，材料周圍為一層薄纖維組織包繞，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)皮下及皮膚組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無淋巴細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤，未見細(xì)胞溶解和壞死跡象。 (4)隨著植入時間的延長，各復(fù)合材料植入組植入物的密度逐漸增高，在各時間點(diǎn)與單純DBM組比較均有顯著性差異；S

10、CR組植入物密度與TEB組類似，顯著高于骨髓組和DBM組。掃描電鏡和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，隨時間延長，組織塊內(nèi)PLL-DBM材料逐漸降解吸收，支架材料內(nèi)逐漸形成小血管和新骨。8w時DBM開始降解，支架材料內(nèi)有大量細(xì)胞和少數(shù)小血管形成，植入TEB內(nèi)可見部分新生骨形成；12w時DBM支架部分降解，組織塊內(nèi)有較多的小血管長入，新骨亦明顯增加；16w時植入?yún)^(qū)可見較為堅(jiān)硬的骨性組織，并有血管長入。TEB組掃描電鏡和組織學(xué)改變與SCR組類似，優(yōu)于骨髓組和

11、DBM組。 (5)PLL-DBM的富集效果隨PLL濃度增大而逐漸增加。0.1％PLL修飾的富集材料對人骨髓NCs濃度富集倍數(shù)為3.18±0.31倍、粘附率達(dá)53％±12％，對血小板富集倍數(shù)為3.88±0.68倍、粘附率達(dá)34％±10％，對骨髓干細(xì)胞即CFU-F的濃度富集倍數(shù)為5.25±1.40倍、粘附率達(dá)73％±13％、選擇率達(dá)1.41±0.34。0.1％PLL修飾的富集材料與更高濃度PLL制備的PLL-DBM比較無明顯差異，說

12、明PLL-DBM對NCs的粘附具有一定的飽和性。富集后TEB中促成骨生長因子TGF-β1的濃度富集倍數(shù)為42.327±4.561，PDGF的濃度富集倍數(shù)為9.618±1.251，富集技術(shù)可以顯著提高TEB中TGF-β1和PDGF含量。 (6)隨時間延長，植入?yún)^(qū)成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原、整合素α2β1和骨鈣素的表達(dá)均逐漸增高，16w時達(dá)高峰，SCR組和TEB組表達(dá)相似，顯著高于骨髓組和DBM組；免疫組化和RT-PCR法顯示成骨早期SCR

13、組Cbfα1mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，隨著骨組織的逐漸成熟，Cbfα1的表達(dá)逐漸下降，16w時表達(dá)明顯減弱。SCR組Cbfα1的表達(dá)與TEB組類似，優(yōu)于骨髓組和DBM組。 結(jié)論： (1)制備的PLL-DBM具有自體骨三維空間結(jié)構(gòu)和促進(jìn)細(xì)胞粘附的PLL，具有良好的細(xì)胞相容性、組織相容性和可降解性，能促進(jìn)hMSCs的粘附與增殖，對DOC的成骨活性無影響，是一種較理想的骨髓干細(xì)胞富集材料。( 2)SCR技術(shù)快速制備的

14、TEB植入體內(nèi)后能夠成骨，并可以達(dá)到與體外培養(yǎng)的hMSCs復(fù)合制備的TEB同樣的成骨效果。 (3)PLL-DBM能明顯增高骨髓有核細(xì)胞、血小板和CFU-F的濃度富集倍數(shù)和粘附率，顯著提高TEB中TGF-β1和PDGF含量；推測SCR技術(shù)快速構(gòu)建TEB后局部高濃度的骨髓干細(xì)胞和促成骨生長因子TGF-β1與PDGF，可能是SCR技術(shù)構(gòu)建的TEB高成骨活性的可能機(jī)制之一。 (4)SCR技術(shù)快速構(gòu)建的TEB，通過在早期促進(jìn)成骨特