線粒體相關(guān)代謝性肌病的生物化學(xué)、分子遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制和藥物治療機(jī)制研究.pdf

1、代謝性肌病是由先天缺陷導(dǎo)致的一類由于體內(nèi)糖原、脂類、線粒體等產(chǎn)能物質(zhì)發(fā)生異常而引起的疾病。代謝性肌病主要包括三類:線粒體肌病、脂肪酸氧化缺陷（fattyacidoxidationdefects，F(xiàn)AODs），和糖原累積病(glycogenstoragediseaseGSDs)。有人也把肌腺苷酸脫氨酶缺乏性肌病(myoadenylatedeaminasedeficiency,MADA)歸為代謝性肌病。臨床表現(xiàn)的類型與肌病的種類有關(guān)。代謝性

2、肌病患者神經(jīng)肌肉異常的臨床表現(xiàn)可以發(fā)生于各種年齡。新生兒和嬰兒多以肌張力低下和多系統(tǒng)受累（包括腦和肝臟）為主要表現(xiàn)。而其他年齡發(fā)病的患者則多表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)不耐受，同時(shí)伴有或不伴有進(jìn)行性肌無力和肌紅蛋白尿。一般而言，糖原累積病(GSD)多表現(xiàn)為對高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的不耐受，而線粒體肌病和脂肪酸氧化異常(FOADs)多表現(xiàn)為對長時(shí)間運(yùn)動(dòng)的不耐受性，或者表現(xiàn)為對禁食和其他應(yīng)激狀態(tài)的不耐受性。
　　線粒體在代謝性肌病發(fā)病機(jī)制中起到?jīng)Q定性作用，直接影響

3、ATP生成系統(tǒng)和產(chǎn)能。除了在線粒體病中發(fā)現(xiàn)的一系列線粒體DNA突變之外，近年來人們逐漸認(rèn)識到由核基因突變引發(fā)的線粒體缺陷并不在少數(shù)，該類疾病符合孟德爾遺傳定律。例如常染色體隱性遺傳的線粒體神經(jīng)消化道肌病（MNGIE，TP基因）、Leigh病(NDUF和SURF-1基因)、線粒體DNA耗竭綜合征(dGuOK和TK)以及一些線粒體DNA缺失綜合征(twinkle，OPA1)。常染色體顯性遺傳基因缺陷導(dǎo)致的線粒體缺失綜合征雖然罕見，但也存在。

4、還有一些罕見的基因突變影響了線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。這些由單基因突變引發(fā)的遺傳代謝性肌病所影響的靶蛋白絕大多數(shù)是最終在線粒體基質(zhì)內(nèi)發(fā)揮催化作用的酶類，這些酶類的缺乏導(dǎo)致了線粒體內(nèi)部電子傳遞、DNA原料合成和底物轉(zhuǎn)運(yùn)，最終影響整個(gè)線粒體的氧化功能效率。
　　本研究主要涉及兩種代謝性肌病，一種是由核基因ETFDH突變導(dǎo)致的多種?；o酶A脫氫缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪酸氧化異常，即多酰基輔酶A脫氫缺陷(MultipleCoenzymeADehydro

5、genationDeficiency，MADD)，ETFDH基因編碼產(chǎn)物ETF-QO蛋白位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)各種長度酯酰輔酶A脫氫后的向線粒體呼吸鏈的電子傳遞。因此本病既屬于脂肪酸氧化缺陷類代謝性肌病，又與線粒體內(nèi)部的電子傳遞密切相關(guān)。另外一種是由核基因TK2突變導(dǎo)致的線粒體DNA耗竭綜合征（MtDNADepletionSyndrome，MDS），該基因突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物胸苷激酶2（ThymidineKinase2）活性極度減低，致使線粒

6、體DNA合成原料dNTP嚴(yán)重缺乏，引起線粒體DNA耗竭，最終導(dǎo)致線粒體內(nèi)部由線粒體DNA編碼的各類蛋白表達(dá)缺陷而發(fā)病。作為對線粒體相關(guān)疾病研究的拓展，我們采用鈣成像系統(tǒng)進(jìn)一步研究某些藥物（如格列苯脲）對線粒體膜電位的改變、及其與氧自由基和鈣離子超載等線粒體代謝相關(guān)環(huán)節(jié)之間的相互作用。
　　第一部分:維生素B2對核黃素反應(yīng)性多?；o酶A脫氫缺陷（RR-MADD）患者成纖維細(xì)胞中黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的上調(diào)和對黃素蛋白的穩(wěn)定作用

7、
　　核黃素反應(yīng)性多?；o酶A脫氫缺陷（RR-MADD）被證實(shí)與線粒體內(nèi)多種酶功能缺陷有關(guān)，但直到最近幾年，該病的遺傳缺陷才被明確，RR-MADD是由電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白（Electrontransferflcwoprotein，ETF）或電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白脫氫酶（Electrontransferflowoprotein-ubiquinomoxidoreductase，ETF-QO）缺陷所引起。雖然致病基因已經(jīng)明確，但其對維生素B2（即

8、核黃素）治療有效的原理，以及核黃素對線粒體相關(guān)酶類的表達(dá)及活性的影響尚不完全明確，甚至處于研究的初始階段。本研究通過收集我院就診的7例RR-MADD患者肌肉組織和體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，并對經(jīng)不同濃度核黃素處理的細(xì)胞內(nèi)的ETF-QO和琥珀酸脫氫酶(succincotedehydrogenase，SDH)的表達(dá)和活性進(jìn)行檢測。同時(shí)檢測各濃度下黃素腺嘌呤二核苷酸(FlawinAdenincDinucleotide，F(xiàn)AD)的在線粒體中的濃度。

9、我們的研究結(jié)果表明患者成纖維細(xì)胞和治療前肌肉中線粒體內(nèi)的FAD含量較正常對照明顯減低，體外細(xì)胞培養(yǎng)中加入核黃素后，ETF-QO蛋白量表達(dá)明顯升高，最終與對照組一致?；颊呒∪夂统衫w維細(xì)胞中的SDH表達(dá)及活性在加藥前也輕度低于正常對照，而在加入核黃素后表達(dá)量和活性均明顯提高至正常水平。線粒體FAD含量在加入核黃素后同樣得到明顯上調(diào)。由此我們得出結(jié)論:在RR-MADD患者線粒體中存在異常的FAD池和明顯減低的黃素蛋白表達(dá)（以ETF-QO和SD

10、HA為代表），這些黃素蛋白的低表達(dá)可能影響線粒體其它蛋白的正常功能。核黃素能夠上調(diào)線粒體FAD的水平，近而促進(jìn)異常的ETF-QO蛋白分子與FAD輔基結(jié)合形成全酶，穩(wěn)定的全酶不易于降解，從而提高了蛋白的穩(wěn)定性。
　　第二部分基于iTRAQ多重標(biāo)記技術(shù)對核黃素反應(yīng)性多酰基輔酶A脫氫缺陷患者服用核黃素前后的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　多?；o酶A脫氫缺陷(MADD)是一種累及骨骼肌，以運(yùn)動(dòng)不耐受、易疲勞為主要表現(xiàn)的疾病。該病的無明顯誘

11、因，易于復(fù)發(fā)，部分患者服用核黃素（維生素B2）可使癥狀自行緩解，稱為核黃素反應(yīng)性MADD(RR-MADD)。本研究首次采用相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽多重標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)iTRAQ(isobarictagforrelativeandabsolutequantitation)，在“整體”蛋白組范圍內(nèi)，對RR-MADD患者用藥前后的肌肉組織進(jìn)行高通量的“全組”蛋白直接鑒定和相對定量分析，繪制出RR-MADD疾病特異性蛋白質(zhì)圖譜，以獲得參與R

12、R-MADD調(diào)節(jié)通路的新的關(guān)鍵因素。為進(jìn)一步闡明RR-MADD的發(fā)病機(jī)制及核黃素的治療機(jī)理提供新的方法和依據(jù)。iTRAQ是一種基于串聯(lián)質(zhì)譜方法的蛋白質(zhì)定量技術(shù)。本次試驗(yàn)采用的8標(biāo)iTRAQ試劑，其中包括8種等量的同位素試劑，能對蛋白質(zhì)酶解后肽段進(jìn)行標(biāo)記，從而通過串聯(lián)質(zhì)譜方法，可以對肽段進(jìn)行精確鑒定和定量。結(jié)果共鑒定了四百多個(gè)蛋白質(zhì)。與用藥前相比，用藥后標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)兩倍以上表達(dá)差異的蛋白質(zhì)419個(gè)，其中上調(diào)的208個(gè)，下調(diào)的211個(gè)。我們

13、對在用藥前出現(xiàn)低表達(dá)的線粒體相關(guān)蛋白、細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了Westernblot驗(yàn)證，分析了以上蛋白表達(dá)水平與RR—MADD和核黃素治療的相關(guān)性，并提出RR-MADD致病模型和RR-MADD核黃素治療轉(zhuǎn)歸模型（即“核黃素開關(guān)”模型）。以上模型有望成為核黃素治療RR-MADD機(jī)制的關(guān)鍵點(diǎn)，并有望為其他類型非代謝類疾病的治療從代謝的角度給出新的啟發(fā)。本研究采用該技術(shù)獲得了RR-MADD患者口服核黃素治療前后肌肉蛋白質(zhì)組差異表達(dá)圖譜;深入研

14、究這些蛋白的分子機(jī)制將有助于進(jìn)一步闡明RR-MADD的發(fā)病機(jī)理，為核黃素對RR-MADD的治療機(jī)制提供新的理論支持。
　　第三部分:TK2基因新發(fā)突變導(dǎo)致的嬰兒發(fā)病的線粒體DNA耗竭綜合征(MDS)一例及其家系研究
　　線粒體胸苷激酶2(TK2)是線粒體內(nèi)的一種脫氧核苷酸激酶，它主要負(fù)責(zé)催化胸苷和脫氧胞苷的第一步磷酸化，使之變成相應(yīng)的單磷酸腺苷。在本研究中，我們報(bào)道中國首例骨骼肌型的線粒體DNA耗竭綜合征，患者為嬰兒起病，主

15、要表現(xiàn)為肌張力低下，逐漸進(jìn)展，5個(gè)月后因呼吸衰竭死亡。肌肉活檢顯示標(biāo)本中存在大量COX缺失纖維，伴有大量的脂滴沉積。我們對患者和其父母的血DNA進(jìn)行TK2基因外顯子測序，結(jié)果顯示患者本人及其父親均帶有5號外顯子內(nèi)的一個(gè)新發(fā)點(diǎn)突變(p.R104H)。隨后對其一家三口行多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）檢測發(fā)現(xiàn)患者及其母親體內(nèi)均帶有TK2基因5-10號

16、外顯子的一段長于19.5kb的大片段缺失。體外培養(yǎng)患者成纖維細(xì)胞并檢測線粒體酶活性顯示呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅱ活性輕度下降，復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ活性明顯下降?；颊咄庵苎图∪饨M織中線粒體DNA拷貝數(shù)明顯減低，而其母親外周血線粒體DNA拷貝數(shù)也呈中度減低。該病例及其家系研究進(jìn)一步豐富了目前國際上報(bào)道的線粒體DNA耗竭綜合征臨床表現(xiàn)形式，主要特點(diǎn)為嬰兒起病，同時(shí)存在線粒體和脂類代謝異常?；颊邤y帶的片段缺失長度較大，導(dǎo)致TK2活性嚴(yán)重減低，可能是導(dǎo)致其

17、早期發(fā)病和嚴(yán)重表型的主要原因。
　　第四部分:格列苯脲對巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧的抑制和線粒體活性的改變以及降低ATP介導(dǎo)的鈣離子濃度升高
　　目前已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明格列苯脲（glibenclamide）有廣泛的抗炎癥反應(yīng)作用。然而，目前仍未出現(xiàn)格列苯脲對Raw264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)靜息和ATP誘導(dǎo)狀態(tài)下胞內(nèi)鈣離子濃度[Ca2+]i變化的相關(guān)研究。在本研究中[Ca2+]i的瞬變活性氧(ROS)檢測以及線粒體功能檢測都通過高速TI

18、LLvisION數(shù)字化成像系統(tǒng)完成。在對相應(yīng)指示劑如Furo2-am，DCFDA和rhodamin-123的監(jiān)測下獲取。我們發(fā)現(xiàn)格列苯脲吡那地爾(pinadile)和其它非選擇性鉀離子通道抑制劑對Raw264.7細(xì)胞中的靜息[Ca2+]i無影響。細(xì)胞外ATP濃度的升高（100μm）能夠引起[Ca2+]i的一過性升高，這主要是通過耗竭鈣庫來實(shí)現(xiàn)的。一過性鈣增高能夠在ROS清除劑（鈦劑）和線粒體抑制劑（魚藤酮）的作用下受到抑制。格列苯脲和5

19、-羥基癸酸(5-hydroxydecanoaye，5-HD)同樣也能降低ATP誘導(dǎo)的鈣增高，但是吡那地爾和非選擇性K+通道抑制劑則對此毫無作用。此外格列苯脲能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量和線粒體的活性。在被鈦劑和魚藤酮預(yù)先處理過的細(xì)胞中格列苯脲的加入無法降低[Ca2+]i的一過性升高。然而外源性的過氧化氫(H2O2)可以克服格列苯脲的作用。由此我們得出結(jié)論:格列苯脲能抑制ATP介導(dǎo)的[Ca2+]i一過性升高，其原理是通過阻斷Raw264.7巨