針對(duì)性殺傷K19陽(yáng)性細(xì)胞在腫瘤基因治療中的價(jià)值初探.pdf

1、研究目的：構(gòu)建角蛋白19（K19）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因（HSV-TK）載體系統(tǒng)，探討其在腫瘤的基因治療中的意義。
　　 材料與方法：
　　 pK15-Tk來(lái)自賓夕凡尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院George Cotsarelis教授的饋贈(zèng)。PAM212是一種惡性轉(zhuǎn)化的小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞系，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院Stuart Yuspa教授饋贈(zèng)，第二軍醫(yī)大學(xué)李晉處獲得。
　　 基因組DNA抽提試劑盒及Pfu T

2、aq酶購(gòu)自申能博彩，PrimeSTAR'HS DNA多聚酶購(gòu)自大連寶生物。PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自E.Z.N.A公司。DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和Opti-MEM均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。
　　 1.K19啟動(dòng)子的擴(kuò)增和載體的構(gòu)建
　　 用基因組DNA抽提試劑盒從出生4天內(nèi)Balb/c小鼠的皮膚組織中抽提基因組DNA，處死新生

3、鼠后，將其在70%酒精中飄洗兩遍，在無(wú)菌環(huán)境下剝除部分皮膚，接下來(lái)的具體方法參照說(shuō)明書。
　　 PCR方法從Balb/c小鼠的基因組DNA中擴(kuò)增出K19啟動(dòng)子區(qū)域。PCR中使用了兩套引物來(lái)擴(kuò)增兩種不同大小的K19啟動(dòng)子片段。擴(kuò)增完整序列(－2.1Kb)的引物是CGGCTCGAGAAGTTCCTTTCTAAGACCCA (K19F1)和AGGACTAGTGGAAAAAGGGACGCAGGTCT (K19R)；擴(kuò)增部分序列（－0.5

4、Kb）的引物是AGGCTCGAGTTATCACAAGGAGGGAGGGA (K19F1)和AGGACTAGTGGAAAAAGGGACGCAGGTCT (K19R)。分別在兩對(duì)引物5’端引入Xho 1和 Spe I的酶切位點(diǎn)。使用Pfu Taq酶從0.2ug基因組中擴(kuò)增K19(－0.5Kb)反應(yīng)條件：初始變性在95℃ 4分鐘后，30個(gè)循環(huán)分別為95℃變性、退火57℃、延伸72℃均為60秒，最后延伸為72℃8分鐘。用PrimeSTAR'HS

5、 DNA多聚酶從0.5ug基因組DNA中擴(kuò)增K19(－2.1Kb)反應(yīng)條件：初始變性在95℃ 4分鐘后，30個(gè)循環(huán)分別為98℃變性、退火54℃、延伸72℃分別為10S、15S和兩分鐘，最后延伸為72℃10分鐘。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離，用膠回收試劑盒純化，Xho 1和 Spe I限制內(nèi)切酶酶切5小時(shí)后再次瓊脂糖電泳分離、膠回收試劑盒純化。所得DNA片段與pK15-tk酶切后的片段用連接試劑盒16℃連接1小時(shí)，GaCl2法轉(zhuǎn)化DH5

6、a感受態(tài)細(xì)胞。構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)酶切、瓊脂糖電泳鑒定后將符合的克隆送測(cè)序。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
　　 Pam212細(xì)胞系和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549以及人宮頸癌細(xì)胞系Siha和Hela在DMEM培養(yǎng)基（添加10％胎牛血清）中培養(yǎng)。每三到四天換液，接近融合時(shí)消化成單細(xì)胞懸液接種在6孔板中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染依照說(shuō)明書進(jìn)行，簡(jiǎn)言之，細(xì)胞接種在6孔板后，一般經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后達(dá)到90%融合且生長(zhǎng)在對(duì)數(shù)期，脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA以6μl：4μg的比例分

7、別在250ul Opti-MEM中稀釋，將二者混勻后加入培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)48小時(shí)的培養(yǎng)后，換液并加入GCV（濃度為100 μM）。
　　 3.MTT細(xì)胞活力測(cè)定
　　 首先，0.2μg質(zhì)粒DNA和0.5μl的脂質(zhì)體分別在25μl的Opti-MEM中稀釋，混勻后的復(fù)合物加入96孔板中，20分鐘后100ul的單細(xì)胞懸液被直接接種到孔板中，在培養(yǎng)箱中經(jīng)過(guò)48小時(shí)的培養(yǎng)后，GCV依照不同濃度加入培養(yǎng)液中（0，2μM，10

8、μM，100 μM）。72小時(shí)過(guò)后，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。
　　 4.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)
　　 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含有100μMGCV的培養(yǎng)液中孵育72小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，消化成單細(xì)胞懸液，1500RPM離心5分鐘，再次用PBS洗，在預(yù)冷的70%乙醇中放置過(guò)夜，離心去除乙醇，用含PI(propidium iodide)的DNA染色劑避光染色半小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.GCV

9、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的PAM212、A549細(xì)胞死亡呈劑量依賴性
　　 MTT結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞以PAM212為例，加入GCV72小時(shí)后，用不加GCV組結(jié)果調(diào)零后，2μM濃度組有19.4%的細(xì)胞死亡，10mM和100mM分別為44.4%和 58.7%。A549的結(jié)果與之較為相似，但是出乎我們意料的是，兩種人宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha在轉(zhuǎn)染后并沒(méi)表現(xiàn)出對(duì)GCV的敏感性，細(xì)胞活力各組之間沒(méi)有明顯的差別。
　　 2.細(xì)胞周期分析