重組核小體通用性Th表位誘導(dǎo)SLE口服免疫耐受的實驗研究.pdf

1、研究背景及研究目的 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性、累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，好發(fā)于青年女性，其確切病因和發(fā)病機制尚未闡明，發(fā)病率有逐漸增高趨勢。目前臨床上主要以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺等非特異性免疫抑制劑治療為主，雖然可以在一定程度上控制病情進展，但由于疾病的進展和長期治療帶來的毒副作用使SLE患者的平均壽命明顯短于正常人。這種以免疫系統(tǒng)的普遍抑制為代價的療法，在發(fā)揮治療作用的同時，往往也造成患者多器官或系統(tǒng)

2、的損傷。因此有必要探索一種可控性的免疫治療措施，這種措施只抑制特定的自身反應(yīng)性淋巴細胞克隆，這是SLE等自身免疫性疾病防治研究的方向，其中治療或預(yù)防性肽耐受疫苗被認為最具發(fā)展前景。 應(yīng)用特異性抗原誘導(dǎo)免疫耐受治療自身免疫病已有很長歷史。該方法可高度選擇性地抑制針對特定抗原的淋巴細胞克隆，而對機體正常免疫功能基本沒有影響，克服了傳統(tǒng)化學(xué)類藥物的毒副作用。早期多應(yīng)用完整抗原來進行免疫耐受的研究取得較好效果，但應(yīng)用結(jié)構(gòu)復(fù)雜抗原作為耐受

3、原存在易激發(fā)自身免疫的缺陷，且來源也比較困難。目前已明確不論是內(nèi)源性或外源性抗原必須經(jīng)過APC內(nèi)部的蛋白酶降解以后，以短肽表位-MHC復(fù)合物的形式提呈在APC表面，才能被T細胞受體識別，進而誘導(dǎo)T細胞及B細胞的活化。由于器官特異性和非器官特異性AID一般由T細胞直接介導(dǎo)或T細胞調(diào)節(jié)，因此誘導(dǎo)T細胞的免疫耐受在理論上便可以預(yù)防或治療AID。且相對于B細胞，誘導(dǎo)T細胞的免疫耐受相對容易，需要的抗原量較少，維持時間較長。與完整或大分子抗原相比

4、，肽疫苗更容易誘導(dǎo)機體免疫耐受，而且可大規(guī)模化學(xué)合成，易于純化，使用也相對安全。基于上述理論，用自身抗原的Th細胞表位代替完整抗原進行AID的免疫耐受，即制備治療性肽耐受疫苗逐漸成為AID防治研究的熱點。 自身抗原表位的篩選和鑒定是AID耐受性肽疫苗研究的關(guān)鍵。誘導(dǎo)SLE發(fā)病的自身抗原來自于凋亡的外周血單一核細胞，種類繁多，目前已明確核小體是誘導(dǎo)SLE發(fā)病及介導(dǎo)組織損傷的重要或關(guān)鍵致病性抗原，阻斷核小體的免疫病理反應(yīng)具有潛在的防

5、治SLE的意義。國外一些研究顯示，核小體T細胞表位肽H2B10-33、H416-39和H471-94等均能通過靜脈注射的途徑取得較好免疫耐受效果，具體表現(xiàn)在核小體表位肽可以阻斷狼瘡鼠致病性抗體的產(chǎn)生，推遲狼瘡性腎炎的發(fā)生時間，阻止疾病進展，延長生存時間。因此，本實驗在上述實驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合我科郝進博士篩選確定的H2B14-28是H2B組蛋白Th細胞免疫優(yōu)勢表位之一，并通過靜脈注射表位肽證實其能誘導(dǎo)SLE癥狀鼠免疫耐受，將表位肽H2B14

6、-28通過減毒鼠傷寒沙門菌直接在腸道內(nèi)表達誘導(dǎo)SLE口服免疫耐受在理論上是可行的。 pCDR1是國外實驗室針對鼠病原性抗DNA抗體的互補決定區(qū)(CDR1)篩選和鑒定出的潛在免疫優(yōu)勢Th細胞表位(16/6基因型)，用于預(yù)防或治療狼瘡鼠的SLE樣癥狀的研究。研究發(fā)現(xiàn)，pCDR1靜脈注射，可改善免疫原誘導(dǎo)的BALB/c狼瘡鼠、(NZBxNZW)F1鼠狼瘡樣癥狀，有腎臟內(nèi)免疫復(fù)合物沉積和蛋白尿的鼠數(shù)量減少，提示使用pCDR1能夠預(yù)防SL

7、E樣癥狀的發(fā)生。因此，我們同時選擇pCDR1作為Th細胞表位對照肽。 口服耐受相對于其他免疫耐受誘導(dǎo)途徑，具有安全性好，少見激發(fā)自身免疫的現(xiàn)象，而且方便、可操作性強，沒有劑量的嚴格限制。應(yīng)用口服耐受治療一些自身免疫性疾病目前已經(jīng)進入Ⅰ期甚至Ⅱ期的臨床實驗。然而，直接口服表位(10-20個氨基酸的短肽)在腸道內(nèi)容易降解，且價格昂貴。減毒鼠傷寒沙門菌能靶向感染樹突狀細胞等專職APC，是目前較常用的口服疫苗載體，具有安全、無副作用、易

8、于給藥且具有長時間保護作用的特點。作為工程菌能直接在腸壁表達表位肽(使所需表達的蛋白無需在體外產(chǎn)生、分離、純化和鑒定)，而且表達的蛋白可直接通過腸壁微褶細胞傳遞給抗原提呈細胞，有效避免目的蛋白的降解。因此，本實驗擬采用以減毒鼠傷寒沙門氏菌作為工程菌直接在腸壁表達核小體表位的形式，來進行SLE口服耐受的研究。并將CTLA4-Ig基因同時轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門氏菌中，通過競爭性阻斷B7與CD28結(jié)合，進一步控制腸上皮DCs可能發(fā)生的活化，誘導(dǎo)調(diào)

9、節(jié)性T細胞和無能性T細胞的生成，達到預(yù)防和治療SLE的最終目的。 基于上述理由，本課題用減毒鼠傷寒沙門菌SL7207、X4550(asd突變株)作為工程菌，設(shè)計引物，通過touchdownPCR法構(gòu)建具有分泌表達CTLA4-Ig-H2B14-28、CTLA4-Ig-pCDR1和CTLA4Ig融合蛋白的重組真核表達載體，并通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細胞、Westernblot、免疫組化檢測融合蛋白的表達。同時將H2B14-28和pCDR

10、1Th細胞表位分別通過全基因合成等基因克隆的方法，構(gòu)建到能在X4550中攜帶的asd+質(zhì)粒pYA3149上，經(jīng)修飾后再電轉(zhuǎn)入X4550，構(gòu)建重組菌株X4550(pYA3149-H2B14-28)和X4550(pYA3149-pCDR1)，在體外誘導(dǎo)表達，Dotblot驗證重組菌對表位肽的表達。 將重組菌株喂飼BALB/c小鼠，用凋亡的同系淋巴細胞制備SLE癥狀模型，觀察誘導(dǎo)口服免疫耐受的效果。 實驗結(jié)果 根據(jù)基因

11、庫中H2B14-28、pCDR1和人CTLA4-Ig的基因序列，設(shè)計上下游引物，將細胞表位設(shè)計在下游引物中，以pCTLA4-Ig-IRES2-EGFP為模板，通過touchdownPCR法從擴增出CTLA4-Ig，同時引入表位基因。HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后定向插入pCDNA3.1(+)載體，陽性質(zhì)粒的酶切鑒定和基因測序結(jié)果與實驗設(shè)計相符。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞，48h后細胞裂解上清進行免疫印跡和免疫組化，結(jié)果表明，pcDNA

12、3.1(+)-CTLA4-Ig-H2B、pcDNA3.1(+)-CTLA4-Ig-pCDR1和pcDNA3.1(+)-CTLA4-Ig質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞均有融合蛋白的表達。將重組菌株喂飼BALB/c鼠，取脾臟分別以羊抗人CTLA-4多克隆抗體和抗表位肽多克隆抗體為一抗免疫組化顯示在脾臟細胞中散在胞漿呈黃褐色的陽性細胞，說明在體內(nèi)有融合蛋白的表達。 全基因合成H2B14-28和pCDR1，在多肽羧基端(C端)引入6-His標簽，等摩爾比

13、混合后退火互補，與表達載體pYA3149連接，陽性質(zhì)粒的酶切鑒定和基因測序結(jié)果與實驗設(shè)計相符。體外IPTG誘導(dǎo)重組菌株X4550(pYA3149-H2B14-28)和X4550(pYA3149-pCDR1)表達蛋白，將誘導(dǎo)后的細菌裂解上清直接點膜行斑點印跡，用鼠抗His單抗作一抗顯示有陽性表達，從而證實我們構(gòu)建的重組菌株能表達目的蛋白。體外傳代穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，在有選擇壓力下傳代后的重組菌株，所含重組質(zhì)粒均保持較高穩(wěn)定性，95％以上無

14、重組質(zhì)粒的丟失。在無選擇壓力組，僅70％～80％仍保有重組質(zhì)粒。體內(nèi)穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，重組菌可成功定居于脾臟、Peyer's結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)上述組織，且其中的活菌計數(shù)和組織內(nèi)活菌質(zhì)粒的陽性率均隨口服接種時間的延長呈緩慢下降趨勢。 結(jié)論 1.用基因工程原理和方法，成功構(gòu)建了能在減毒鼠傷寒沙門菌中表達的核小體Th細胞表位H2B14-28和CTLA4-Ig的重組表達質(zhì)粒，并同時構(gòu)建分別表達CTLA4-Ig、CTLA4

15、-Ig-pCDR1、pCDR1和H2B14-28等的對照組質(zhì)粒。在體外，重組表達質(zhì)粒經(jīng)過DOTAP法轉(zhuǎn)染COS-7細胞、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達后，Westernblot、細胞免疫組化和Dotblot鑒定表達的是目的蛋白。 2.將構(gòu)建表達CTLA4-Ig-H2B、CTLA4-Ig-pCDR1和CTLA4-Ig的減毒鼠傷寒沙門菌SL7207喂飼Balb/c小鼠，取脾臟進行免疫組化鑒定重組蛋白在動物體內(nèi)的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脾臟免疫細胞胞漿

16、中有陽性表達，說明我們構(gòu)建的重組真核表達質(zhì)粒能通過減毒鼠傷寒沙門菌被攜帶到動物體內(nèi)，并在體內(nèi)成功表達有生物學(xué)活性的蛋白。 3.以同系凋亡淋巴細胞免疫BALB/c小鼠制備SLE樣癥狀小鼠模型，給予口服免疫構(gòu)建的重組減毒鼠傷寒沙門菌菌株進行免疫耐受的誘導(dǎo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，CTLA4-Ig-H2B能明顯降低實驗小鼠ANA、ds-DNA和抗核小體抗體等自身抗體的水平，對白細胞減少和蛋白尿有明顯的改善作用，對腎臟損傷有明顯的保護