大麻素Ⅱ型受體激動(dòng)劑改善阿爾茨海默病樣小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的神經(jīng)炎癥機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　以大麻素Ⅱ型受體(cannabinoid2 receptor, CB2R)激動(dòng)劑為研究工具，研究CB2R對(duì)β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的改善作用及其調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型轉(zhuǎn)化的神經(jīng)源性炎癥作用機(jī)制。為確立CB2R作為新的抗神經(jīng)源性炎癥候選藥物靶標(biāo)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為治療阿爾茨海默病提供新的藥物治療策略。
　　方法:
　　1 CB2R激動(dòng)劑對(duì)AD模型小鼠空間及非空間

2、學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　根據(jù)自發(fā)活動(dòng)的研究數(shù)據(jù)將10周齡雄性C57/B16J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，AD模型組，CB2R激動(dòng)劑JWH-015干預(yù)組和JWH-015單藥組。對(duì)照組和JWH-015單藥組側(cè)腦室一次性注射生理鹽水8μl。AD模型組和JWH-015干預(yù)組動(dòng)物側(cè)腦室一次性注射寡聚態(tài)Aβ1-424μg(8μl)，以建立AD模型。造模后第2天開(kāi)始，JWH-015干預(yù)組和JWH-015單藥組小鼠腹腔注射JWH-015（0.5mg/kg

3、/天），對(duì)照組和AD模型組小鼠每天腹腔注射等體積含0.1％ DMSO生理鹽水，連續(xù)給藥3周。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)觀察CB2R激動(dòng)劑對(duì)AD模型小鼠空間及非空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。
　　2 CB2R激動(dòng)劑對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞功能形態(tài)及數(shù)量的影響
　　通過(guò)組織免疫熒光技術(shù)觀察上述不同組別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(CD11b)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（GFAP）的表達(dá)情況和CB2R激動(dòng)劑對(duì)上述改變的影

4、響。
　　3 CB2R激動(dòng)劑對(duì)Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞功能和激活表型的影響
　　采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，觀察海馬、紋狀體、前額葉等腦區(qū)的CB2R，M1型激活小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物TNF-α、iNOS、IL-6及M2型激活小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Ym1/2 mRNA的表達(dá)情況。
　　4 CB2R對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　通過(guò)Western Blot的方法觀察CB2R對(duì)LPS誘導(dǎo)的激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激

5、酶信號(hào)通路ERK、JNK及p38 MAPK磷酸化水平的影響，探討CB2R參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活功能表型調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1 CB2R激動(dòng)劑改善AD模型小鼠空間和非空間學(xué)習(xí)記憶能力
　　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，AD模型組小鼠逃避潛伏期較對(duì)照組小鼠顯著延長(zhǎng)(P＜0.01);在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，AD模型組小鼠1分鐘穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P＜0.05);新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

6、示，與對(duì)照組相比，AD模型組小鼠新物體識(shí)別指數(shù)顯著下降（P＜0.05），提示AD模型建立成功。與AD模型組小鼠相比，JWH-015干預(yù)組小鼠逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.05)，1分鐘穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P＜0.05); JWH-015干預(yù)組小鼠新物體識(shí)別指數(shù)較AD模型組小鼠相比顯著增加(P＜0.05)，提示CB2R激動(dòng)劑能夠改善AD模型小鼠空間及非空間學(xué)習(xí)記憶能力;JWH-015單藥組小鼠與對(duì)照組相比，逃避潛伏期、1分鐘穿越平臺(tái)次數(shù)及

7、新物體識(shí)別指數(shù)均無(wú)顯著變化(P＞0.05);此外，各組小鼠體重及自發(fā)活動(dòng)未見(jiàn)組間差異，提示JWH-015不影響正常小鼠體重及精神活動(dòng)。
　　2 CB2R激動(dòng)劑抑制腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量
　　通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)不同處理組小鼠紋狀體腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和海馬腦區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活與表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，AD模型組小鼠紋狀體腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b表達(dá)明顯增高，形態(tài)表現(xiàn)為分枝狀（激活狀態(tài)）;JWH-015干預(yù)組小鼠紋狀體腦區(qū)C

8、D11b的表達(dá)與AD模型組相比明顯下降;JWH-015單藥組較對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異。AD模型組小鼠海馬腦區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP較對(duì)照組表達(dá)顯著增高;JWH-015干預(yù)組小鼠GFAP的表達(dá)水平較AD模型組有減少的趨勢(shì);JWH-015單藥組與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。
　　3 CB2R調(diào)節(jié)腦內(nèi)Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2激活表型的轉(zhuǎn)化
　　3.1 Aβ誘導(dǎo)腦內(nèi)不同腦區(qū)CB2RmRNA表達(dá)水平上調(diào)
　　與對(duì)照組相比，AD

9、模型組小鼠海馬、紋狀體和前額葉等腦區(qū)CB2RmRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（海馬P＜0.01，紋狀體和前額葉P＜0.05）。與AD模型組相比，JWH-015干預(yù)組小鼠海馬、紋狀體和前額葉等腦區(qū)CB2RmRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)（海馬P＜0.01，紋狀體和前額葉P＜0.05）。
　　3.2 CB2R激動(dòng)劑降低M1型激活小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)水平
　　在海馬腦區(qū)，與對(duì)照組小鼠相比，AD模型組小鼠iNOS mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(

10、P＜0.01)。與AD模型組相比，CB2R激動(dòng)劑干預(yù)組小鼠iNOSmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.01)。模型組IL-6，TNF-α mRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，JWH-015干預(yù)組IL-6，TNF-α mRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)。單藥組與對(duì)照組相比，其TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。
　　在紋狀體腦區(qū)，AD模型組小鼠腦內(nèi)iNOS，IL-6，TNF-α mRNA表達(dá)較對(duì)照組均顯著升高（P值分別為

11、P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05）。與模型組相比，JWH-015干預(yù)組小鼠腦內(nèi)iNOS，IL-6，TNF-α mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)（分別為P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05）。與對(duì)照組相比，單藥組TNF-α、iNOS、IL-6 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　在前額葉腦區(qū)，與對(duì)照組相比，AD模型組小鼠腦內(nèi)iNOS，IL-6 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P值分別為P＜0.01，P＜0.05）。與AD模型組相比

12、，JWH-015干預(yù)組小鼠腦內(nèi)iNOS，IL-6 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P均＜0.01）。TNF-α mRNA表達(dá)各組間未見(jiàn)顯著改變(P＞0.05)。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CB2R激動(dòng)劑JWH-015通過(guò)激活CB2R可下調(diào)AD模型小鼠腦內(nèi)M1型激活小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及其促炎癥功能。
　　3.3 CB2R激動(dòng)劑上調(diào)M2型激活小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA表達(dá)
　　在海馬腦區(qū)，與對(duì)照組小鼠相比，AD模型組小鼠腦內(nèi)M2型激活小膠質(zhì)細(xì)

13、胞標(biāo)記物Ym1/2mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。與AD模型組相比，JWH-015干預(yù)組小鼠腦內(nèi)Ym1/2 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　在紋狀體腦區(qū)，與對(duì)照組小鼠相比，AD模型組小鼠腦內(nèi)Ym1/2mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，JWH-015干預(yù)組小鼠腦內(nèi)Ym1/2mRNA表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。
　　在前額葉腦區(qū)，AD模型組小鼠腦內(nèi)Ym1/2 mRNA表達(dá)

14、水平較對(duì)照組顯著下調(diào)(P＜0.05)。與AD模型組相比，JWH-015干預(yù)組小鼠腦內(nèi)Ym1/2mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)。JWH-015單藥處理組Ym1/2 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CB2R激動(dòng)劑JWH-015可上調(diào)AD模型小鼠腦內(nèi)M2型激活小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)及其抗炎作用。
　　4 CB2R激動(dòng)劑顯著抑制LPS誘導(dǎo)的M1型BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2和JNK磷酸

15、化水平
　　與對(duì)照組相比，LPS處理組BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞ERK磷酸化水平顯著增高(P＜0.01);JWH-015低劑量處理組(10 nM)與LPS處理組相比，ERK1/2磷酸化水平呈下降趨勢(shì);JWH-015中劑量(100 nM)及高劑量組(1μM)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平顯著下調(diào)(P＜0.01);JWH-015中濃度(100 nM)組對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平升高的抑制作用可被CB2R拮

16、抗劑SR144528所顯著阻斷(P＜0.05)。
　　與對(duì)照組相比，LPS處理組BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化水平顯著增高(P＜0.05);JWH-015能濃度依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的JNK磷酸化水平;JWH-015中濃度(100 nM)組對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞JNK磷酸化水平升高的抑制作用可部分被CB2R拮抗劑SR144528阻斷。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CB2R激活后，下調(diào)ERK和JNK兩個(gè)信號(hào)