HBV X蛋白上調(diào)共刺激分子CD40在肝癌細胞中的表達.pdf

1、乙肝病毒是一種小的雙鏈DNA病毒，是已知的感染人類最小的雙鏈DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。乙肝病毒感染肝細胞后，能引起一系列的疾病，如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等，還往往伴有嚴重的并發(fā)癥。目前世界范圍內(nèi)有超過3.5億人為乙肝慢性感染，其中一部分最終轉(zhuǎn)為肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)，是威脅人類健康的主要的感染性疾病之一。 機體感染HBV后，能否產(chǎn)生有效的抗

2、病毒細胞免疫反應(yīng)清除肝細胞內(nèi)的病毒決定著HBV感染后的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。由于HBV的感染宿主僅限于人和猩猩，目前僅僅是通過其他肝DNA病毒和黃病毒屬感染其宿主后致病機制的一個間接反映，還有是在細胞和小鼠模型上取得的生化、病毒學(xué)、免疫學(xué)等方面的進展。研究發(fā)現(xiàn)，造成HBV慢性感染的主要原因是不能產(chǎn)生有效的針對相應(yīng)抗原細胞免疫反應(yīng)，有效的抗病毒細胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，包括免疫細胞與抗原呈遞細胞之間的相互作用，也包括可溶性細胞因子的

3、介入。HBV的基因組雙鏈DNA包含一個長鏈和一個短鏈，有四個重疊的開放讀碼框架，分別為：S/preS，C/preC，P和X。HBX能反式激活病毒和細胞基因，包括一些轉(zhuǎn)錄因子、生長調(diào)控基因。大量研究表明HBV的X蛋白會激活多種病毒、細胞的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，被HBx激活的啟動子和增強子包含NF-kappaB，AP-1，AP-2，c-EBP，ATF/CREB或鈣激活因子NF-AT在DNA上的結(jié)合活性。 共刺激分子是細胞表面的一組糖蛋白分

4、子，是T細胞與所有其他宿主細胞相互作用所必須的。在T細胞通過TCR識別特異性抗原的同時，共刺激分子也聚集到免疫突觸部位與其配體結(jié)合后觸發(fā)下游信號傳導(dǎo)，對TCR信號起到正向或負向的調(diào)節(jié)作用，從而影響T細胞的活化，增殖與功能。 首先，我們利用基因芯片技術(shù)，分析HBV感染后肝細胞內(nèi)基因表達譜變化情況。雖然迄今為止，也有很多關(guān)于HBV感染的研究，但人們對其致病機制，特別是慢性乙型肝炎的致病機制還不是很清楚。我們期待通過尋找HBV感染后肝

5、細胞內(nèi)表達發(fā)生特異性改變的共刺激分子，為進一步闡明HBV感染、特別是慢性HBV感染的致病機制提示信息。首先我們利用Operon公司的基因芯片，以整合了HBV全基因組、能分泌HBV病毒顆粒的HepG2.2.15細胞作為HBV感染的細胞模型，以HepG2細胞作為對照，分析兩種細胞基因表達譜，篩選顯著上調(diào)或下調(diào)的基因。HepG2.2.15細胞是人肝癌細胞株HepG2細胞轉(zhuǎn)染HBV基因后的細胞，乙肝病毒基因已穩(wěn)定整合，能分泌各種病毒蛋白和病毒顆

6、粒，是研究乙肝病毒感染的常用的體外模型。所用芯片為Operon公司的35khuman Genome Array，利用該芯片對HepG2.2.15和HepG2細胞的基因表達譜進行分析后，發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)的基因多為癌相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因、細胞骨架和黏附分子以及凋亡相關(guān)基因。說明在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中，抑癌基因的失活、代謝相關(guān)酶類基因活性的異常及促使細胞進入增殖周期的相關(guān)基因的活化等因素發(fā)揮了重要的作用。然而我們更關(guān)注共刺激分子，對差異表達

7、的共刺激分子篩選后發(fā)現(xiàn)在CD40、CD80、CD86、B7RP-1、OX40、B7-H1、B7-DC、B7-H3和B7-H4中只有CD40顯著上調(diào)。經(jīng)實時定量PCR、細胞流式技術(shù)、免疫印記分別進行驗證，最終確認肝細胞中因HBV感染而顯著上調(diào)的共刺激分子CD40，也說明芯片的結(jié)果是可靠的。 腫瘤壞死因子(TNF)和腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族部分成員是共刺激分子的重要組成部分。CD40是腫瘤壞死因子受體家族一成員，表達在B細

8、胞、活化的T細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞和多種肝癌細胞系。CD40在多種細胞的廣泛表達提示在免疫和宿主防御反應(yīng)中發(fā)揮多種功能。并且根據(jù)細胞種類、細胞分化階段的不同所發(fā)揮的作用也不盡相同。CD40L主要表達在活化的T細胞。CD40與其配體CD40L結(jié)合后發(fā)揮的作用主要有調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡和免疫調(diào)節(jié)，即：促使B細胞增殖、B細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白的亞類轉(zhuǎn)換和抑制B細胞的凋亡；傳遞凋亡信號從而抑制惡性淋巴細胞系和一部分肝癌細胞系的生長；增

9、強惡性造血細胞的抗原遞呈和免疫識別、提高惡性B細胞的免疫原性而誘導(dǎo)腫瘤特異性的T細胞免疫。以上信息提示對CD40通路的研究可為癌癥的治療開辟一個全新的視野。 然后，我們根據(jù)adr亞型HBV基因組序列設(shè)計擴增HBV基因組各基因的PCR引物，擴增HBV基因組各基因片段，與真核表達載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建重組子，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后分別命名為pcDNA3.1(+)/HBs、pcDN.A3.1(+)/HBc、pcDNA3.1(+)

10、/HBe、pcDNA3.1(+)/HBp、pcDNA3.1(+)/HB-preS1、pcDNA3.1(+)/HB-preS2、pcDNA3.1(+)/HBx。轉(zhuǎn)染HepG2細胞經(jīng)抗生素G418篩選后獲得穩(wěn)定表達HBV基因組各蛋白的HepG2細胞系，分別命名為HepG2HBs、HepG2HBc、HepG2HBe、HepG2HBp、HepG2HB-preS1、HeoG2HB-preS2、HepG2HBx細胞，并經(jīng)細胞免疫化學(xué)染色和細胞流式技

11、術(shù)分析鑒定各蛋白在細胞中的表達。然后細胞流式技術(shù)分析HBV基因組各蛋白對CD40表達的調(diào)節(jié)作用，最終確定HBV X蛋白上調(diào)了CD40在HepG2細胞中的表達。為進一步驗證HBV X蛋白對共刺激分子CD40表達的上調(diào)作用，采用RT-PCR、定量PCR和細胞流式技術(shù)分析PLC/C4細胞系中共刺激分子CD40的表達，同樣得到HBV X蛋白的表達上調(diào)共刺激分子CD40在PLC細胞的表達的結(jié)果，而X基因被干擾的C4細胞CD40未上調(diào)表達。

12、 綜上所述，我們利用Operon公司的基因芯片，以整合了HBV全基因組、能分泌HBV病毒顆粒的HepG2.2.15細胞作為HBV感染的細胞模型，以HepG2細胞作為對照，分析其基因表達譜篩選顯著上調(diào)或下調(diào)的基因。經(jīng)定量PCR、細胞流式技術(shù)、免疫印記進行驗證，最終得到顯著上調(diào)的共刺激分子CD40。然后，我們根據(jù)adr亞型HBV基因組設(shè)計擴增HBV各基因的PCR引物，構(gòu)建HBV各基因重組子，轉(zhuǎn)染HepG2細胞獲得穩(wěn)定表達HBV各蛋白的Hep