家禽及其暴露人群甲型流感病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查研究.pdf

1、人感染禽流感病毒(avian influenza viruses，AIVs)的事件近年來(lái)報(bào)道愈加頻繁。自從禽流感病毒H5N1于1997年被報(bào)道能夠感染并致人死亡以來(lái)，已在15個(gè)國(guó)家造成658人感染，病死率近60％;禽流感病毒H7N7也于2003年在荷蘭引起1人死亡;其他禽流感病毒如H9N2、H7N3等感染人事件在香港、加拿大等地也有報(bào)道。2013年初，禽流感病毒H7N9人感染病例又在我國(guó)東南部出現(xiàn)，截止2014年2月28日H7N9已經(jīng)造

2、成375人感染，115人死亡。因此，我國(guó)禽間AIVs感染及人群AIVs感染狀況是備受關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。
　　進(jìn)行H7N9禽流感病毒的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，檢測(cè)方法是關(guān)鍵一環(huán)。為了選擇能夠應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)H7N9禽流感病毒的快速、高效的檢測(cè)方法，我們對(duì)5種用于檢測(cè)人甲型流感感染的商品化試劑盒（Life Technologies VetMAXTM-Gold SIV DetectionKit、Quidel Molecular Influenza A+B a

3、ssay、 Remel Xpect Flu A&B assay、 QuidelQuickvue influenza assay以及Quidel Sofia Influenza A+B assay)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。首先從江蘇省無(wú)錫市和南京市采集的健康活禽肛拭子樣本提取RNA，用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qReal-timePCR，qRT-PCR) influenza A

4、 assay和H7N9 assay進(jìn)行甲型流感病毒和禽流感病毒H7N9檢測(cè)，篩選出27個(gè)H7N9陽(yáng)性標(biāo)本、70個(gè)H7N9及甲型流感陰性標(biāo)本。然后對(duì)這97個(gè)標(biāo)本使用上述5種試劑盒進(jìn)行盲法檢測(cè)以及WHO qRT-PCR H7N9assay的復(fù)核。檢測(cè)時(shí)，根據(jù)試劑盒的不同試驗(yàn)原理，核酸分子檢測(cè)方法每種重復(fù)3次，抗原檢測(cè)方法每種重復(fù)2次。最后以WHO qRT-PCR H7N9 assay作金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算這幾種方法的敏感度和特異度及其可信區(qū)間(co

5、nfidence interval，CI)。結(jié)果:(1)WHO qRT-PCR H7N9 assay第一輪和第二輪結(jié)果有很好的一致性。(2)Quidel Quickvue influenza assay對(duì)97份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果全部顯示陰性。其他四種試驗(yàn)方法均有很好的特異度(96-100％)。(3) Life Technologies VetMAXTM-GoldSIV Detection Kit特異度最高，為100％(95％ CI0.87-1

6、.00)，假陽(yáng)性率4％(95％CI1-12％)。Quidel Molecular InfluenzaA+B assay敏感度較高，達(dá)85％(95％ CI66-96％)，假陽(yáng)性率3％(95％ CI0-10％)。
　　為掌握AIVs在無(wú)錫地區(qū)家禽中的感染狀況及其遺傳進(jìn)化特征，我們于2013年7月-12月每月在無(wú)錫市活禽交易市場(chǎng)和家禽養(yǎng)殖場(chǎng)的家禽中采集活禽及其相關(guān)環(huán)境拭子標(biāo)本，以拭子標(biāo)本提取的RNA為模板，運(yùn)用WHO qRT-PCR i

7、nfluenzaA assay對(duì)樣品進(jìn)行甲型流感病毒篩查，對(duì)篩查陽(yáng)性標(biāo)本采用一步法反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行流感病毒全基因組PCR擴(kuò)增以及基因克隆和測(cè)序。測(cè)序所得的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，同時(shí)對(duì)甲型流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行MDCK細(xì)胞及雞胚分離培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果:(1)共采集標(biāo)本305份，甲型流感病毒陽(yáng)性率為28.5％(87/305)。家禽交易市場(chǎng)樣本甲型流感病毒陽(yáng)性率高于養(yǎng)殖場(chǎng)(31.9％ vs.10.4％，x2=9.16，P=0.002);(2)共有

8、6個(gè)樣本可進(jìn)行分型，分別為H9N2（3個(gè)），H5N8（1個(gè)），H11N2（1個(gè)）和H5N1（1個(gè)）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明H5N8和H11N2有不同程度的重組。(3)共分離到3株禽流感病毒:A/Chicken/1/Wuxi/2013(H9N2)、A/Chicken/2/Wuxi/2013(H9N2)和A/Chicken/1/Wuxi/2013(H5N1)。
　　禽間AIVs感染情況復(fù)雜多樣，而禽類(lèi)飼養(yǎng)、加工等職業(yè)暴露人群是感染AIVs的

9、高危人群。除了感染AIVs發(fā)病甚至死亡之外，他們當(dāng)中還存在諸如H5、H7、H9、H11等亞型AIVs的隱性感染者。豬能夠感染豬流感病毒(swine influenzavirus，SIV)，也能感染多種禽源和人源流感病毒，在“禽-豬-人”的種間傳播鏈中扮演著流感病毒中間宿主及多重宿主的作用。研究已證明豬可感染禽流感病毒H5N1和H9N2。廣東、福建、浙江地區(qū)約1％的豬職業(yè)暴露人群中有H9N2感染。因此，為了解禽和豬職業(yè)暴露人群甲型流感病毒

10、的感染狀況，通過(guò)分析感染與一般人口社會(huì)學(xué)情況和流行病學(xué)特征的關(guān)系，確定感染AIVs的危險(xiǎn)因素，為人感染AIVs的防治策略提供依據(jù)，我們?cè)跓o(wú)錫地區(qū)禽（豬）養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、市場(chǎng)和散養(yǎng)戶集中地的暴露人群中開(kāi)展了甲型流感病毒血清學(xué)現(xiàn)況調(diào)查。選擇了禽職業(yè)暴露人群498名，豬職業(yè)暴露人群608名和無(wú)職業(yè)暴露的對(duì)照人群165名，共1271名研究對(duì)象。通過(guò)血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)試驗(yàn)和微量中和(micro

11、neutralization，MN)試驗(yàn)對(duì)研究對(duì)象血清標(biāo)本進(jìn)行了人甲型季節(jié)性流感H1N1(seasonal influenza A/H1N1，sH1N1)、sH3N2，及禽流感病毒H5N1、H9N2和H7N1血清抗體的檢測(cè)。結(jié)果:(1)禽類(lèi)職業(yè)暴露、豬職業(yè)暴露和對(duì)照人群的sH1N1 HI抗體陽(yáng)性率分別為17.7％(88/498)，10.9％(66/608)和27.3％(45/165)，三組sH1N1 HI抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2

12、=29.00，df=2，P=0.000)。sH3N2 HI抗體陽(yáng)性率分別為17.3％(86/498)，6.4％(39/608)和8.5％(14/165)，三組sH3N2 HI抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=34.29，df=2，P=0.000）。(2) H5N1在禽類(lèi)職業(yè)暴露人群當(dāng)中MN滴度≥1∶80和≥1∶160的分別占14.6％和8.4％，在豬職業(yè)暴露人群分別占0.2％和0.2％，對(duì)照人群中只有1名(0.6％)對(duì)象H5N1MN滴度

13、為1∶80，沒(méi)有更高滴度的對(duì)象。多因素logistic回歸分析表明，工作場(chǎng)所為市場(chǎng)的禽類(lèi)職業(yè)暴露人員(OR=57.3，95％ CI7.0-466.5)、慢性呼吸道疾病(OR=12.8，95％ CI1.6-102.5)以及年齡40-60歲(OR=3.1，95％ CI1.5-6.6)為H5N1MN滴度≥1∶80的危險(xiǎn)因素。(3)對(duì)H5N1MN滴度≥1∶80的76份血清再做HI試驗(yàn)，最終按WHO MN滴度≥1∶80且HI滴度≥1∶160的確診

14、病例標(biāo)準(zhǔn)判定有3名H5N1感染者，為2名市場(chǎng)賣(mài)禽人員和1名規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)工人，占禽暴露人群的0.6％(3/498)，這3人中有2人否認(rèn)近一年內(nèi)有流感樣癥狀。(4) H9N2試驗(yàn)結(jié)果有5名研究對(duì)象MN滴度≥1∶10，其中2名是市場(chǎng)賣(mài)禽人員，2名是市場(chǎng)賣(mài)豬肉人員，1名是豬屠宰場(chǎng)工人。H9N2在禽職業(yè)暴露人群和豬暴露人群的MN抗體陽(yáng)性率分別為0.4％(2/498)和0.5％(3/608)。對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)H9N2MN抗體陽(yáng)性者。(5)H7N1

15、HI試驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)抗體滴度≥1∶10者。
　　H7N9禽流感病毒2013年初在中國(guó)東南部出現(xiàn)人感染病例，并在短期內(nèi)呈迅速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)?；钋菁跋嚓P(guān)環(huán)境（包括活禽市場(chǎng)）暴露被認(rèn)為是感染H7N9的首要危險(xiǎn)因素。在H7N9疫情延續(xù)期間，禽暴露人群是否有隱性感染？活禽市場(chǎng)的活禽從業(yè)人員和非活禽從業(yè)人員，以及活禽市場(chǎng)以外的禽類(lèi)從業(yè)人員相比，感染的風(fēng)險(xiǎn)是否相同？感染與社會(huì)人口學(xué)、基礎(chǔ)疾病、職業(yè)行為等因素又有什么樣的關(guān)系？基于這些科學(xué)問(wèn)題，我們?cè)跓o(wú)錫

16、地區(qū)禽職業(yè)暴露人群中開(kāi)展了H7N9的血清學(xué)現(xiàn)況調(diào)查，共納入對(duì)象1588名，包括1178名活禽市場(chǎng)從業(yè)人員（300名活禽從業(yè)人員和878名非活禽從業(yè)人員），245名活禽市場(chǎng)以外的活禽從業(yè)人員和165名當(dāng)?shù)亟】稻用瘛?shí)驗(yàn)方法選擇火雞血HI檢測(cè)A/Anhui/1/2013(H7N9)血清抗體，HI滴度≥1∶20的再用MN試驗(yàn)復(fù)核，MN滴度≥1∶20的判為陽(yáng)性。為考察可能的交叉反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)sH1N1、sH3N2以及LPAI H7N1抗體，結(jié)果

17、按二分類(lèi)變量形式納入H7N9感染危險(xiǎn)因素的單因素logistic回歸檢驗(yàn)。結(jié)果:(1)HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果有27份標(biāo)本(1.7％)HI抗體滴度≥1∶20，再由MN復(fù)核，結(jié)果有8份標(biāo)本(0.5％)MN滴度≥1∶20。這8份抗-H7N9中和抗體陽(yáng)性標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的研究對(duì)象分別為無(wú)錫7個(gè)區(qū)（縣）8個(gè)不同活禽市場(chǎng)的從業(yè)人員，其中7名活禽從業(yè)人員，1名為非活禽從業(yè)人員，H7N9抗體陽(yáng)性率在活禽市場(chǎng)活禽從業(yè)人員中為2.3％(7/300)，在非活禽從業(yè)人員中為0

18、.1％(1/878)。這8名研究對(duì)象均否認(rèn)一年內(nèi)有流感樣癥狀。(2)所有研究對(duì)象禽流感病毒H7N1的HI結(jié)果均為陰性。(3)二分類(lèi)單因素logistic回歸分析顯示，活禽市場(chǎng)活禽從業(yè)人員感染H7N9的風(fēng)險(xiǎn)高于活禽市場(chǎng)非活禽從業(yè)人員(OR=20.95，95％ CI2.57-171.01)。性別之間、不同年齡組之間、不同文化程度和不同收入水平之間抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。sH1N1、sH3N2感染與H7N9感染也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。
　　

19、結(jié)論:(1) Life Technologies VetMAXTM-Gold SIV Detection Kit和QuidelMolecular Influenza A+B assays對(duì)活禽肛拭子進(jìn)行禽流感病毒H7N9檢測(cè)的效果與WHO推薦的H7N9 qRT-PCR assay基本一致。(2)江蘇省無(wú)錫地區(qū)禽間AIVs感染情況復(fù)雜多樣，有H5N1、H5N8、H9N2和H11N2等，H5N8和H11N2很可能是重組毒株。(3)職業(yè)暴露人

20、群AIVs感染普遍，禽暴露人群中存在較高水平的禽流感病毒H5N1感染以及低水平的H7N9和H9N2感染，豬暴露人群中也存在低水平的H5N1和H9N2感染。這些感染者很可能是隱性或輕癥感染。(4)工作場(chǎng)所為市場(chǎng)的禽類(lèi)職業(yè)暴露人員、慢性呼吸道疾病以及年齡40-60歲為H5N1的感染危險(xiǎn)因素。(5)活禽市場(chǎng)的活禽從業(yè)人員感染H7N9的危險(xiǎn)高于活禽市場(chǎng)非活禽從業(yè)人員。因此，禽類(lèi)職業(yè)暴露人群，特別是市場(chǎng)禽類(lèi)從業(yè)人群，以及有呼吸道慢性疾病禽類(lèi)暴露人

21、群是AIVs的防控重點(diǎn)人群。加強(qiáng)活禽市場(chǎng)的管理、環(huán)境消毒和人員防護(hù)是控制AIVs傳播的必要手段。對(duì)禽類(lèi)和職業(yè)暴露人群AIVs感染狀況進(jìn)行系統(tǒng)、連續(xù)地監(jiān)測(cè)有著重要的公共衛(wèi)生意義。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)包括:(1)用HI和MN兩種方法串聯(lián)，證實(shí)了活禽市場(chǎng)禽暴露人群中存在禽流感病毒H7N9隱性感染，而活禽市場(chǎng)以外禽暴露人群中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)H7N9隱性感染;(2)在同一禽暴露人群中發(fā)現(xiàn)多種AIVs隱性感染，包括H5N1、H7N9和H9N2感染;(