人DC-SIGN基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及功能學(xué)鑒定.pdf

1、樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素（dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule3 grabbingnonintergrin，DC-SIGN）是樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）表面的一種新型凝集素受體[1]，在調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞黏附、遷移，激活初始T淋巴細(xì)胞，啟動免疫應(yīng)答，以及病原體的免疫逃逸等多方面發(fā)揮重要作用[2-6]，是結(jié)核病干預(yù)策略中

2、的新靶標(biāo)。DC-SIGN是DCs表面結(jié)核桿菌的主要受體。結(jié)核桿菌可通過其胞壁成分一帶甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖（mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM）與DC-SIGN分子結(jié)合，抑制DCs成熟[7-10]。DCs在抗結(jié)核免疫應(yīng)答中發(fā)揮著中心作用，它是唯一能激活初始T細(xì)胞，啟動初始免疫應(yīng)答的抗原提呈細(xì)胞[6，8]。而DCs要發(fā)揮活化初始T細(xì)胞的作用，其前提是必須成熟。RNA干擾（RNA interf

3、erence，RNAi）是一種可高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)并在基因功能研究和基因治療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景的技術(shù)[11，12]。慢病毒表達(dá)載體是RNAi常用的載體之一，能將自身攜帶的片斷整合入宿主細(xì)胞基因組，在哺乳動物各類細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），長期抑制基因表達(dá)[13]。
　　 本研究根據(jù)人DC-SIGN基因的mRNA序列選擇4條靶序列，設(shè)計合成雙鏈DNA，并經(jīng)

4、PCR擴(kuò)增、DNA測序以及外源性篩選，確定RNAi有效靶序列，構(gòu)建并包裝產(chǎn)生人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表達(dá)載體。利用構(gòu)建成功RNAi慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的DCs，通過流式細(xì)胞儀、RT-PCR以及Western blot檢測DCs表面DC-SIGN分子表達(dá)水平變化，流式細(xì)胞儀檢測DCs表面成熟標(biāo)志物HLA-DR及CD86水平，ELISA檢測DCs培養(yǎng)上清液中IL-12、IL-10分泌水平，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

5、檢測DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。通過以上研究以明確慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾對DCs表面DC-SIGN分子表達(dá)水平的抑制程度以及對DCs成熟度和功能的影響。
　　 研究結(jié)果：PCR擴(kuò)增和DNA測序結(jié)果證實，DC-SIGN核苷酸鏈序列插入正確，外源性篩選確定兩條有效靶序列。選擇其中一條有效靶序列包裝慢病毒，產(chǎn)生濃縮慢病毒懸液的滴度為1×109TU/mL。利用人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DCs，流式細(xì)胞術(shù)、

6、PCR及WB檢測均提示DCs表面DC-SIGN表達(dá)水平降低，流式細(xì)胞儀顯示各組間成熟標(biāo)志物HLA-DR及CD86差異無統(tǒng)計學(xué)意義，ELISA結(jié)果顯示各組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示各組DCs誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)論：本研究建立了一種穩(wěn)定、有效的轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞來源的DCs的方法，并能在體外細(xì)胞水平有效抑制DC-SIGN表達(dá)，慢病