丹參酮ⅡA磺酸鈉防治脂多糖性急性肺損傷的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性呼吸窘迫綜合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）是多種因素引起的以急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）為特征，并有較高死亡率的疾病。它可導(dǎo)致非心源性呼吸衰竭，目前尚缺乏特異有效的治療方法。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是ARDS的常見致病因素。大量的研究證明，LPS能結(jié)合單核/巨噬細胞表面的CD14受體，并與宿主細胞相互作用后使

2、細胞產(chǎn)生大量的細胞因子與炎性介質(zhì)，其中，磷脂酶A2（phospholipaseA2，PLA2）被認為在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。PLA2的代謝產(chǎn)物、血小板活化因子（plateletactivatingfactor，PAF）和類花生酸類物質(zhì)都參與ARDS的形成。
　　丹參酮（tanshinone）具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗血栓形成和抗炎等，常在中醫(yī)中被用來治療炎性疾病。丹參酮IIA（tanshinoneIIA,TI

3、IA）在丹參中含量最多，丹參酮IIA磺酸鈉（sodiumtanshinoneIIAsulphonate,STS）是丹參酮IIA的衍生物。近些年來，許多文獻報道丹參酮IIA具有抑制炎性介質(zhì)與氧自由基釋放的作用，但有關(guān)其對內(nèi)毒素引起的ALI的保護作用及其機制的研究比較少。本實驗擬觀察STS對LPS所致小鼠ALI的預(yù)防及治療作用和對細胞損傷的保護作用，觀察STS對內(nèi)毒素性小鼠死亡率的影響，并進一步研究其發(fā)揮作用的可能機制。
　　實驗?zāi)康?/p>

4、：
　?。?）觀察STS對LPS導(dǎo)致的ALI的防治作用
　?。?）觀察STS對內(nèi)毒素性小鼠死亡率的影響
　?。?）觀察STS是否通過抑制PLA2活力減輕LPS導(dǎo)致的ALI，為STS的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)
　　實驗方法：
　　動物實驗：
　　雌性KM小鼠（18～22g）適應(yīng)環(huán)境后，腹腔注射LPS建立小鼠肺損傷模型，隨機分為五組：生理鹽水（NS）對照組（n=32），STS對照組（n=32），LPS組（n=

5、32），STS+LPS組（n=32）及LPS+STS組（n=32）。在NS組、STS組與LPS組，以0.01ml/g的體積和體重比分別腹腔注射NS、STS（10mg/kg）和LPS（10mg/kg）。在STS+LPS組，LPS給予前0.5小時注射STS（10mg/kg）；在LPS+STS組，LPS注射1小時后給予STS（10mg/kg）。在NS或LPS注射后6小時取小鼠右肺進行病理觀察，測定左肺濕/干重比值（W/D）、左肺/體重比值（L

6、/B）、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）中蛋白含量、肺組織髓過氧化物酶（MPO）活力、肺組織勻漿與BALF中PLA2活性、BALF中血栓素B2（TXB2）含量，以及Westernblotting檢測小鼠肺核蛋白中NF-κB的含量以代表其活化程度。
　　為觀察STS對動物死亡率的影響，實驗動物適應(yīng)環(huán)境后，腹腔注射LPS（50mg/kg）建立小鼠內(nèi)毒素血癥模型，隨機將其分為三組：LPS

7、組（n=10），STS+LPS組（預(yù)處理組，n=20）及LPS+STS組（治療組，n=20）。在STS+LPS組，LPS給予前0.5小時注射STS（30或50mg/kg）；在LPS+STS組，LPS注射1小時后給予STS（30或50mg/kg）。小鼠注射LPS后，每12小時記錄一次小鼠的死亡情況，連續(xù)記錄三天。
　　細胞實驗：
　　模擬肺環(huán)境觀察STS對LPS所致的肺上皮細胞損傷的保護作用，肺泡上皮細胞系A(chǔ)549細胞與肺泡巨

8、噬細胞系NR8383細胞分別以1:1或5:1的比例共同培養(yǎng)。用0～20μg/ml的STS處理24小時，部分細胞在STS預(yù)處理2小時后被LPS（1μg/ml）刺激24小時，所有的細胞用PBS洗三次去除NR8383細胞，采用MTT法檢測A549細胞的活力；將A549細胞調(diào)制濃度為1×106/ml，并以1:1與5:1的比例與NR8383細胞共同培養(yǎng)，在0～20μg/ml的STS預(yù)處理2小時或未處理的情況下，用LPS（1μg/ml）刺激細胞12

9、小時，測定上清液中LDH的含量。
　　為了探討STS是否通過直接作用影響PLA2的活性，將NR8383巨噬細胞調(diào)制濃度為1×106/ml接種在24孔培養(yǎng)板，細胞中加入0～20μg/mlSTS，2小時后部分細胞被LPS（1μg/ml）或melittin（一種PLA2激動劑）（3μg/ml）刺激6小時，測定上清中PLA2的活力。
　　實驗結(jié)果：
　　動物實驗：
　　形態(tài)學(xué)觀察表明LPS組中肺組織明顯充血、水腫并有大量

10、的炎性細胞浸潤，而在STS+LPS組及LPS+STS組內(nèi)毒素所致的肺損傷明顯減輕，肺組織結(jié)構(gòu)均趨于正常；W/D、L/B、BALF中蛋白含量與肺勻漿MPO活力在LPS組均較對照組明顯升高（P<0.01），但在STS+LPS組和LPS+STS組上述指標(biāo)較LPS組明顯減低（P<0.05）。
　　LPS組小鼠肺勻漿與BALF中PLA2活性為[（49.2±4.3）U與（40.8±6.5）U]，均高于正常對照組[（23.8±4.8）U與（27

11、.2±6.9）U]，而在STS+LPS組及LPS+STS組分別降至[（29.0±5.8）U,（30.0±5.8）U]與[（31.4±4.9）U,（31.0±3.8）U]，與LPS組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。LPS組小鼠BALF中TXB2含量高于正常對照組（P<0.01）；而在STS+LPS組及LPS+STS組降低，與LPS組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。Westernblotting結(jié)果顯示LPS能顯著增加胞核中NF-κB的含量，表明NF-

12、κB活化；而在STS+LPS組及LPS+STS組其活化明顯降低。
　　30或50mg/kgSTS預(yù)處理組小鼠3天死亡率分別為50％和40％，比LPS組（80％）顯著降低（P<0.05）；STS預(yù)處理組小鼠的生存時間分別為（50.3±7.19）h與（51.62±7.89）h，比LPS組（32.80±6.30）h顯著延長（P<0.05）。但是，LPS注射后給予30或50mg/kg的STS治療并不能顯著降低小鼠的死亡率（70％），也不能

13、明顯延長其生存時間。
　　細胞實驗：
　　MTT結(jié)果顯示0～20μg/ml的STS對A549細胞的活力沒有影響，1μg/ml的LPS顯著降低其活力（P<0.01），STS能濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)LPS導(dǎo)致的細胞活力的下降；LPS能增加上清中LDH含量，STS同樣濃度依賴性地抑制LPS導(dǎo)致的LDH含量的升高。
　　在NR8383細胞中，STS本身對PLA2的活力沒有影響，LPS和melittin都使PLA2活力顯著升高（P<0

14、.01）。不同濃度的STS均能抑制LPS所致的PLA2活力的增高，而且具有劑量依賴性。但是不同濃度的STS對melittin所致的PLA2活力的增高沒有影響。
　　結(jié)論：
　?。?）STS對LPS導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷有預(yù)防和治療作用。
　　（2）STS對LPS所致的肺泡上皮細胞損傷具有保護作用。
　?。?）STS雖然不能逆轉(zhuǎn)內(nèi)毒素導(dǎo)致的小鼠死亡，但STS預(yù)處理能降低小鼠的死亡率并能顯著延長動物的平均生存時間。