IL-7-IL-7R促進肺癌淋巴管形成和轉移的機制.pdf

1、白介素—7(Interleukin—7，IL—7)是一種能誘發(fā)造血細胞和惡性腫瘤發(fā)生和增殖的細胞因子，在乳腺癌細胞系IL—7通過磷脂酰肌醇—3—激酶(phosphatidylinositol3—kinase，PI3K)敏感徑路誘發(fā)乳腺癌細胞的生長，這對研究乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有著重要意義。卵巢癌可刺激宿主免疫細胞分泌IL—7，血清和腹腔液IL—7升高是宿主免疫系統(tǒng)抗腫瘤作用的一種表現(xiàn)。IL—7作為一種具有潛在抗腫瘤作用的免疫調節(jié)活性因子，

2、其在腹水中水平升高不及血清顯著，推測腹腔局部可能存在某些免疫抑制因素。提高腹腔局部IL—7水平可對卵巢癌有治療意義。目前IL—7在腫瘤中的作用不一，作用機制也不清楚。 目的： 本研究探討IL—7在肺癌中的表達，分析它們與各臨床病理因素之間的關系，揭示IL—7在肺癌細胞侵襲和轉移過程中的作用機制。 驗材料和方法： 一、材料 100例原發(fā)性非小細胞肺癌癌組織及癌旁正常肺組織標本均來自1980年到200

3、5年在中國醫(yī)科大學附屬一院實行手術的病人，患者術前均未接受放化療。標本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶免疫組化法(streptavidin-Peroxidase，S-P法)檢測組織中IL—7、IL—7R和血管內皮生長因子—D(vascular endothelial growth factor—D，VEGF—D)蛋白表達情況，微血管密度(microvessel density，MVD)

4、和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：IL—7、IL—7R和VEGF—D以細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。光鏡下每張切片選取癌細胞較多的10個高倍視野計數(shù)100個癌細胞中的陽性細胞數(shù)，IL—7、IL—7R(Interleukin—7Receptor)和VEGF—D的評估為：無陽性細胞為“—”，陽性細胞數(shù)≤5％為“+”，陽性細胞數(shù)為5％—20％為“++”，>20

5、％為“+++”，其中“++”和“+++”為高表達，“—”和“+”為低表達。血管和淋巴管判定標準為：內皮細胞形成條狀、裂隙狀等孤立結構棕黃染色或有管腔者按一條血管或淋巴管計數(shù)。低倍光鏡下確定3個微血管或淋巴管高密度區(qū)域(熱點)，然后在高倍鏡下分別計數(shù)每個熱點中3個區(qū)域的CD34染色(用于標記MVD)和D2—40(用于標記LVD)染色陽性管腔數(shù)均值。MVD=(CD34陽性管腔數(shù)—D2—40陽性管腔數(shù))均值；LVD=D2—40陽性管腔數(shù)均值。

6、當計數(shù)相差10％以上時則重新計數(shù)。 二、細胞培養(yǎng) 分別用含10％新鮮胎牛血清的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)人肺巨細胞癌細胞系PG—LH7和NCI—H460、人肺腺癌細胞系A549和SPC—A1和人肺鱗癌細胞系SK—MES—1。 三、逆轉錄—聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 提取細胞總RNA，按RT-PCR(TaKaRa)試劑盒方法進行逆轉錄反應，反應體系為20μL，取4

7、μL的RT產(chǎn)物進行PCR反應，反應體系為20μL。PCR引物經(jīng)在GeneBank上比對后在bio—spring公司合成。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。 四、Western Blot法 在收集的細胞內加入裂解液充分裂解，低溫高速離心(4℃，12000轉/min，30min)，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12％SDS-PAGE凝膠)、轉印(50V，120min)、5％

8、正常小牛血清封閉，一抗c—Jun(1：200)、phosphorylated—c—Jun(p—c—Jun，1：200)、c—Fos(1：200)、VEGF(1：200)、VEGF—D(1：200)和β—actin(1：200)，抗體均購自Santa Cruz，USA，4℃孵育過夜，分別與各自對應的二抗(1：2500，chemicon，USA)室溫孵育2h，3，3’—二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，結果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(Chemi I

9、mager5500，Alpha Innotech，USA)采集，進行灰度值測定。 五、染色質免疫沉淀法 加入37％的甲醛使A549細胞內的蛋白和DNA充分交聯(lián)，裂解細胞，超聲剪切DNA片段(80w，30次)，免疫沉淀交聯(lián)的蛋白和DNA，洗脫蛋白/DNA復合物，逆轉蛋白/DNA復合物交聯(lián)，純化DNA，做PCR，重復三次，取平均值。 六、免疫共沉淀法 在收集的新鮮培養(yǎng)的細胞中加入裂解液，充分裂解后，每管分別加

10、入100ul磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)和20ul c—Jun抗體，使終體積為1ml，4℃孵育30min，用蛋白裂解液沖洗u柱(Miltenyi Biotec，Germany)，將蛋白樣加入u柱，加入20ul的95℃預熱上樣緩沖液，孵育5min，用50ul的95℃預熱上樣緩沖液沖洗，收集液體，做Western blot，重復三次，取平均值。 七、細胞遷移和侵襲能力檢測 在transwell小室(

11、Coming公司)下室加入600ul含10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基，上室中加入100ul無血清DMEM培養(yǎng)基，接種A549細胞數(shù)為2.5×104個。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)6hr后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后，甲醇室溫固定15min，用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細胞侵襲能力的測定用預冷的無血清培養(yǎng)基以1：7稀釋Matrigel(BD Biosciences，USA)加入上室

12、100ul，在室溫下放置6h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈，其他與遷移實驗相同，培養(yǎng)18hr后觀察結果。 八、MTT法檢測細胞增殖 將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含103個細胞，培養(yǎng)24h，每孔加入MTT(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium bromide)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO，490nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線。

13、 九、體內裸鼠移植實驗 將24只4周齡裸鼠背部皮下注射A549細胞(2×107個/只)，1周后(有腫瘤形成)隨機分成4組，每組6只。以后每周1次，每次50ul背部皮下注射。一組：注射PBS；二組注射IL—7(20mg/ml)；三組注射IL—7(20mg/ml)+IL—7R(50mg/ml)；四組注射IL—7R(50mg/ml)。10周后處死。觀察瘤大小，并取瘤組織檢測其他指標。 十、數(shù)據(jù)分析 使用SPSS13

14、.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 結論： 1、IL—7/IL—7R高表達與非小細胞肺癌的分期、淋巴結轉移和預后不良正相關，與VEGF—D的表達正相關，IL—7/IL—7R和VEGF—D高表達組腫瘤中的LVD明顯高于低表達組。 2、在肺癌IL—7R+細胞中IL—7通過IL—7R調控AP—1復合物中c—fos，c—Jun表達及磷酸化，促進c—fos和c—Jun形成異二聚體，并與VEGF—D基因