高強度聚焦超聲波殺傷細粒棘球絳蟲棘球蚴的研究.pdf

1、囊性棘球蚴病是細粒棘球絳蟲后絳幼蟲棘球蚴寄生所致的一種嚴重的人獸共患慢性寄生蟲病，也稱包蟲病。棘球蚴寄生引起的包蟲病呈世界性分布。目前包蟲病的治療手段包括手術和藥物治療，效果均不理想。無論是傳統開腹手術還是腹腔鏡內、經皮穿刺介入治療等微創(chuàng)治療等手術治療方式均具侵入性。術中包囊液及棘球蚴砂溢漏會引起過敏性休克甚至死亡，術后因頭節(jié)的外漏和殘留導致棘球蚴病繼發(fā)感染以及引起殘腔感染、積液、膽漏等多種嚴重并發(fā)癥。苯并咪唑衍生物阿苯達唑是現有抗棘球

2、蚴病的治療首選藥物，但因其低溶解性和在體內廣泛的分布性，阿苯達唑治療包蟲病存在著病人服藥治療時間長、藥物的副作用較大、治療不徹底等問題。 高強度聚焦超聲波（High Intensity Focused Ultrasound，HIFU）技術是利用超聲波聲束良好的穿透性、匯聚性和方向性等特點，將體外低能量超聲波匯聚于機體內特定靶區(qū)，通過在焦點處產生高溫效應，空化效應、聲化學效應等高能效應破壞組織細胞。HIFU作為一種新興的無創(chuàng)性治療

3、技術，已在臨床試用于腫瘤治療。 本課題將這種非侵入性高強度聚焦超聲波治療技術應用于囊性棘球蚴，觀測高強度聚焦超聲波對細粒棘球蚴細胞，局部結構原頭節(jié)以至整個寄生蟲生長的影響作用及其可能機制，探索高強度聚焦超聲波這一新興治療技術運用于棘球蚴病以至其它囊性病變的可能性和可行性。 研究方法： 1、從自然感染的綿羊棘球蚴獲取內囊分離生發(fā)細胞進行體外培養(yǎng)，電鏡及免疫熒光試驗鑒定生發(fā)細胞；MTT法篩選HIFU對生發(fā)細胞增殖影響

4、的最佳作用參數；以致10％急性生發(fā)細胞死亡率的HIFU劑量處理細胞后，AnnexinV/PI熒光染色、電鏡、熒光顯微鏡結合流式細胞儀觀測HIFU對細胞凋亡、細胞周期的影響；檢測HIFU作用后細胞內Caspase-3蛋白酶活性；Western blot檢測P53、BcL-2/Bax和Fas等凋亡相關蛋白表達。 2、分離原頭節(jié)，觀察不同劑量的HIFU照射原頭節(jié)后的即刻殺滅作用，獲得劑量-效應關系；以不致原頭節(jié)即刻殺傷的超聲劑量作用后

5、，根據臺盼藍排斥法染色結果以及原頭節(jié)形態(tài)變化確定原頭節(jié)死亡率，了解HIFU對原頭節(jié)生長的遲發(fā)性影響；將此種輻照原頭節(jié)接種小鼠進行返種實驗，根據棘球蚴在體內囊濕重及包囊形態(tài)學改變，了解HIFU對原頭節(jié)的感染能力的影響；同時行酶化學染色檢測原頭節(jié)酸性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脫氫酶的活性變化。 3、用采自自然感染的綿羊棘球蚴的原頭節(jié)接種小鼠腹腔，建立小鼠繼發(fā)性棘球蚴病動物模型；配對動物模型小鼠進行HIFU輻照實驗，HIFU焦點

6、緊貼包囊內壁做多層面的曲線閉環(huán)連續(xù)掃描，層面間距4mm，直至輻照完整個包囊；小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2月，通過比較對照組和HIFU處理組的小鼠棘球蚴包囊減重率，觀察囊壁的形態(tài)改變及TUNEL法檢測囊壁細胞凋亡等，評價HIFU殺傷棘球蚴的效果；并通過ELISA法檢測血清IgG抗體水平及細胞因子IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10的變化，流式細胞儀淋巴檢測淋巴細胞亞群的變化，RT-PCR檢測小鼠脾淋巴細胞細胞因子mRNA表達情況等實驗手段，了解H

7、IFU作用后小鼠免疫功能的改變。 研究結果： 1、分離的細胞電鏡下表現為分化較低，較符合生發(fā)細胞功能特點，免疫熒光試驗鑒定細胞表面確有細粒棘球蚴抗原成分；20W×20S，40W×10s和160W×5S為致10％急性生發(fā)細胞死亡率的HIFU劑量；經此劑量的HIFU處理后，AnnexinV/PI熒光染色、電鏡觀察、熒光顯微鏡結合流式細胞儀實驗結果一致：HIFU對超聲照射后存活生發(fā)細胞生長具有明顯的抑制作用并可誘導生發(fā)細胞凋亡

8、；胞內Caspase-3蛋白酶活性增加；未見P53、BcL-2/B ax和Fas等凋亡相關蛋白蛋白表達。 2、HIFU對原頭節(jié)有明顯的急性殺傷作用，隨著超聲照射劑量增大，其生物學效應越明顯，聲功率大于200W短時照射就極易致原頭節(jié)全部即刻死亡；不致原頭節(jié)即刻殺傷的最大超聲劑量為25W×20S和50W×10S。經此劑量的HIFU作用后全部存活的原頭節(jié)，體外培養(yǎng)過程中死亡率明顯較對照組增高，而原頭節(jié)返種實驗時在小鼠體內形成棘球蚴的數

9、量/能力亦降低；原頭節(jié)葡萄糖6-磷酸酶和琥珀酸脫氫酶活性較對照組明顯減弱，而酸性磷酸酶反應產物與對照組相比無明顯變化。 3、成功建立小鼠繼發(fā)性棘球蚴病動物模型；經HIFU以多層面貼壁曲線閉環(huán)掃描方式作用后，繼續(xù)飼養(yǎng)至觀察期滿的小鼠體內的棘球蚴包囊明顯減重，有縮小、實變等形態(tài)改變，囊壁結構明顯不如對照組正常、完整并觀測到細胞凋亡；動物模型血清IgG抗體水平無明顯變化，小鼠血清及脾淋巴細胞CD4+/CD8+比值升高，小鼠血清及脾細胞

10、IFN-γ，IL-2等Th1型細胞因子含量升高，IL-4，IL-10等Th2型細胞因子水平降低。 研究結論： 1、HIFU輻照不但在體外對生發(fā)細胞和原頭節(jié)這兩種棘球蚴組成成分有明顯的急性殺傷作用，而且能夠抑制輻照后的生發(fā)細胞和原頭節(jié)生長； 2、HIFU輻照能夠抑制棘球蚴在小鼠動物模型體內的生長； 3、HIFU的殺滅機制與其高能效應直接破壞、促進生發(fā)細胞凋亡、抑制原頭節(jié)酶的活性以及重新激發(fā)宿主對棘球蚴有效的