Klebsiella oxytoca ZU-03發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的研究.pdf

1、2，3-丁二醇是一種重要的化工原料及燃料，應(yīng)用前景廣泛。利用豐富而且廉價(jià)的木質(zhì)纖維資源代替有限的糧食原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇，在開發(fā)新能源和環(huán)境保護(hù)等方面具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。本文對(duì)一株克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca ZU-03)發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇主要工藝參數(shù)、半纖維素水解液的主要成分木糖的發(fā)酵、玉米芯的預(yù)處理和酶解工藝、菌種的馴化及對(duì)纖維素水解液發(fā)酵等技術(shù)進(jìn)行了研究。 Klebsiella ox

2、ytoca ZU-03發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的基礎(chǔ)研究結(jié)果表明：適宜的發(fā)酵參數(shù)為初始葡萄糖濃度160g/L，玉米漿濃度6g/L，接種量10％(V/V)，裝液量為50mL(250mL，搖瓶)，轉(zhuǎn)速150rpm，pH值6.5，發(fā)酵溫度30℃。在此優(yōu)化條件下，葡萄糖利用率可達(dá)98％，2,3-丁二醇濃度為74.2g/L，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為0.46g/g，達(dá)到理論值的92％。 木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖，由半纖維素水

3、解生產(chǎn)，含量可達(dá)植物纖維水解糖類的35％以上。傳統(tǒng)的酒精酵母等微生物只能利用葡萄糖，而不能利用木糖，對(duì)于半纖維素的利用一直是國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)Klebsiella oxytoca ZU-03可以木糖發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇。在初始木糖濃度90g/L,玉米漿濃度6g/L，接種量10％(V/V)，pH值5.5，發(fā)酵溫度30℃的條件下，木糖利用率可達(dá)89％，2,3-丁二醇濃度為36.2/L，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為0.40/g，達(dá)到理論值的80

4、％。Klebsiella oxytoca ZU-03對(duì)乙酸比較敏感，乙酸的質(zhì)量濃度增至2g/L時(shí)，發(fā)酵木糖基本停止。添加適量的葡萄糖可促進(jìn)Klebsiella oxytoca ZU-03對(duì)木糖的發(fā)酵。在50g/L木糖與80g/L葡萄糖共發(fā)酵，96 h內(nèi)木糖利用率從以木糖為唯一碳源時(shí)的87.0％提高到96.6％。 分別用稀酸和氫氧化鈉預(yù)處理纖維原料。稀酸預(yù)處理后半纖維素的脫除率達(dá)到87.5％，而木質(zhì)素的脫除率僅為6.3％，預(yù)處理后

5、的半纖維素水解液里含有較高濃度的發(fā)酵抑制物乙酸和糠醛，對(duì)后續(xù)發(fā)酵十分不利；經(jīng)氫氧化鈉預(yù)處理后半纖維素的脫除率僅為33.5％，而對(duì)木質(zhì)素的脫除率達(dá)到73.9％，預(yù)處理后保留了大部分半纖維素，由于葡萄糖和木糖均可以被Klebsiella oxytoca ZU-03利用，發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇，因此氫氧化鈉預(yù)處理更有優(yōu)勢(shì)。采用里氏木霉纖維素酶水解上述兩種不同方法預(yù)處理后的玉米芯纖維殘?jiān)?8h后，酶解得率分別為84.5％和81.2％，還原糖的

6、質(zhì)量濃度分別為61.9 g/L和76.2g/L，綜合考慮，選取氫氧化鈉預(yù)處理方法。采用分批補(bǔ)料酶解工藝，分別在酶解后的12 h和24 h分兩次補(bǔ)料，使底物最終質(zhì)量濃度增加到200g/L，酶解60 h后還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到121.8 g/L。探討了水解液中的有害成分對(duì)Klebsiella oxytoca ZU-03發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水解液中主要的發(fā)酵抑制物為高濃度的鹽。采用逐步提高培養(yǎng)基中水解液濃度的方法對(duì)Klebs

7、iella oxytoca ZU-03進(jìn)行馴化，提高了其對(duì)水解液中菌體發(fā)酵抑制物的耐受力。經(jīng)過12代的馴化，Klebsiella oxytoca ZU-03在水解液中順利生長并發(fā)酵生成2，3-丁二醇，這為水解液預(yù)處理方法的簡化打下了良好的基礎(chǔ)。 利用馴化后的Klebsiella oxytoca ZU-03發(fā)酵糖濃度為121.8 g/L(其中葡萄糖濃度為76.8 g/L，木糖濃度為45 g/L)的玉米芯酶解液，pH值調(diào)為6.0，發(fā)

8、酵108h，葡萄糖利用率為98％，木糖利用率為96％，2，3-丁二醇的濃度為55.4 g/L，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為0.45，達(dá)到理論值的90％。 利用纖維素、半纖維素水解液替代糧食發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義，目前國內(nèi)對(duì)這方面的研究尚屬空白。本文利用馴化后的Klebsiella oxytoca ZU-03發(fā)酵玉米芯水解液生產(chǎn)2，3-丁二醇質(zhì)量轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論值得90％，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對(duì)于促進(jìn)可再生木