結核分枝桿菌哺乳動物細胞入侵因子mce家族Rv0590A基因的性質(zhì)及功能研究.pdf

1、結核病是一種嚴重危害人類健康的傳染病，它是由結核分枝桿菌(Mvcobacterium tuberculosis)引起的一種慢性疾病。結核病發(fā)病率的增加在一些資源短缺國家甚至工業(yè)發(fā)達國家都已是不爭的事實。人們對(Mycobacteriumtuberculosis)的生物特性進行廣泛研究，研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物，使得人類對結核病的控制取得了可喜的成績。然而，化學藥物的不合理應用，耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)，M.tuberculos

2、is與人類免疫缺陷病毒HIV的共感染，人口流動的增加使得結核病疫情下降緩慢，在部分地區(qū)甚至有所回升。開發(fā)出對結核病有效的預防性、治療性疫苗和新型藥物是亟待解決的難題。尋找新的結核藥物作用靶點和開發(fā)新型抗結核藥物己成為當前最受關注的熱點。
　　 M.tuberculosis作為一種胞內(nèi)致病菌，主要存在于單核吞噬細胞內(nèi)。它的一個重要特征是能夠在宿主巨噬細胞內(nèi)存活和增殖，并抑制吞噬小體的酸化和成熟。M.tuberculosis的基因組

3、包含4個哺乳動物細胞入侵因子(mce)操縱子(mcel-4)，每個mce操縱子含有8-13個基因，它們相互毗連且在各操縱子中排列相似。每個操縱子中相對應的基因具有相似的序列及有機組成，編碼與M.tuberculosis入侵以及在宿主巨噬細胞中存活相關的輸出蛋白。mce基因使得重組非致病菌E.coli能夠入侵哺乳動物并在其巨噬細胞中存活，與M.tuberculosis入侵宿主細胞并在其巨噬細胞內(nèi)的持久存活有著密切的關系。Rv0590A作為

4、mce操縱子上一個未知功能的ORF，是mce2操縱子上一個獨有的基因，可能與Mce2R共同調(diào)控mce2的表達。Rv0590A與mce2B組成M.tuberculosis H37Rv的一個中斷編碼序列(ICDS)，與其他18個ICDS共同構成M.tuberculosis和Mycobacterium bovis(M.boris)分化的依據(jù)之一。
　　 本研究通過生物信息學對結核分枝桿菌H37Rv的Rv0590A基因的性質(zhì)及功能進行研

5、究，并對該基因編碼蛋白的結構和功能進行分析和預測，以期為該蛋白的研究提供生物信息學相關的參考依據(jù)。運用TMHMM Serverv.2.0，Jpred，VectorNTI9，Clustal X，SignalP，swiss model等生物信息學資源對Rv0590A的基本性質(zhì)進行了分析，包括對蛋白一級結構(親水性/疏水性，跨膜結構和信號肽等)，二級結構以及三級結構等基本性質(zhì)的預測分析。結果表明：結核分枝桿菌H37RvRv0590A編碼蛋白無

6、信號肽，不存在跨膜結構區(qū)；其二級結構是由2個α螺旋及2個β折疊片構成。同時在一、二級結構分析的基礎上，利用同源建模的方法完成了其三維結構的建模。運用http：//string.embl.de/軟件預測Rv0590A蛋白相互作用網(wǎng)絡，結果表明與其相互作用蛋白主要是同源及與其毗鄰的蛋白即mce2操縱子所編碼的蛋白及其調(diào)節(jié)子Rv0586。與報道的Rv0590A可能與Rv0586共同調(diào)節(jié)mce2的轉錄相互印證。利用比較基因組學分析該蛋白在分枝桿

7、菌屬中的同源和分布情況，結果表明該基因在進化上相對保守。
　　 從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得結核分枝桿菌H37Rv的Rv0590A基因的核苷酸序列，設計兩對引物，分別以結核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板，分別體外擴增獲得Rv0590A基因。分別通過TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T SimpleVector，分別亞克隆至載體pET28a(+)和pcDNA3.1(+)中，經(jīng)菌落PCR以及序列測定證明成功構建了重組質(zhì)粒pE

8、T28/Rv0590A和pcDNA3.1/Rv0590A。將重組質(zhì)粒pET28/Rv0590A轉化Escherichia coli BL21(DE3)，對該重組蛋白質(zhì)進行誘導表達。擴大培養(yǎng)后，采用Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組Rv0590A蛋白，weaern bloting驗證Rv0590A融合表達。我們研究了過表達該蛋白對宿主菌的影響，包括過表達Rv0590A對宿主菌生長，脂肪酸組成以及對宿主菌抗氧化壓力的耐受性研究。將重