慢病毒介導的RNAi沉默p21基因?qū)β谷赘杉毎飳W特性的影響.pdf

1、目的：鹿茸是一種可完全再生的哺乳動物附屬器官，被作為一種生物學模型受到廣大學者的關(guān)注，搞清鹿茸再生機制有望為人類肢體再生提供可借鑒的理論依據(jù)。生茸區(qū)骨膜細胞（APCs）與角柄骨膜細胞(PPCs)分別是鹿茸發(fā)生與再生的關(guān)鍵，均具有干細胞特性，因此也分別稱為鹿茸發(fā)生干細胞(SCAG)與鹿茸再生干細胞(SCAR)。有限的鹿茸干細胞可以在短短的兩個月內(nèi)生成完整的鹿茸組織，這在其他哺乳動物器官組織中是不可能完成的。組織器官再生源于細胞的分裂增殖，

2、細胞的分裂增殖依賴于細胞周期調(diào)控，因此對鹿茸干細胞周期的研究對揭示鹿茸再生機制具有重要意義。p21是一種細胞周期的主要調(diào)控因子，與p53共同構(gòu)成細胞周期的G1檢查點。研究發(fā)現(xiàn) p21單基因敲除使普通小鼠獲得了同 MRL小鼠一樣閉合耳洞的能力，同時相關(guān)再生細胞具有特殊的細胞周期分布（G2/M阻滯），很多再生模型中也都發(fā)現(xiàn)了相同的G2/M積聚現(xiàn)象。但檢測鹿茸干細胞周期，沒有發(fā)現(xiàn)特殊的G2/M期阻滯（未發(fā)表），推測可能與p21基因有關(guān)，為證明

3、這一假設(shè)，并探討p21基因在鹿茸再生中的作用，本實驗通過RNA干擾技術(shù)來研究沉默p21基因?qū)β谷赘杉毎飳W特性的影響。
　　方法：1、利用在線設(shè)計軟件與通用RNAi設(shè)計法則篩選出針對東北梅花鹿p21基因的RNAi高分靶位點，化學合成并體外退火，與載體質(zhì)粒PLVTHM重組，通過PCR鑒定及測序鑒定篩選出陽性質(zhì)粒。2、重組質(zhì)粒與pMD2.G、pCMV-dr8.9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293t細胞，收集并濃縮含有目的基因的慢病毒載體。慢病毒感染

4、，流式細胞儀分選陽性細胞，Q-PCR檢測轉(zhuǎn)染后PP細胞中mRNA表達量。3、MTT法檢測細胞在傳代早期與后期的增殖速率；流式細胞法檢測細胞周期與細胞凋亡；β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老；彗星電泳實驗檢測細胞DN A損傷。
　　結(jié)果：1、成功篩選了2條針對東北梅花鹿P21基因的RNAi高分靶位點并化學合成，體外退火獲得雙鏈寡核苷酸鏈；2、與載體質(zhì)粒PLVTHM連接，成功獲得重組質(zhì)粒；3、通過三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293t細胞，成功獲得大量慢

5、病毒粒子；4、通過感染PP細胞并分選，獲得穩(wěn)定感染的細胞株；5、RT-PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染細胞p21基因mRNA表達量顯著降低；6、對感染后細胞生物學特性檢測發(fā)現(xiàn)：傳代早期細胞增殖速率無顯著變化，傳代后期細胞增殖速度明顯高于對照組；細胞周期無顯著變化；細胞凋亡數(shù)顯著增多；細胞衰老被抑制；細胞DN A損傷明顯增加。
　　結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建了針對東北梅花鹿p21基因的慢病毒表達載體，并獲得了p21基因沉默的穩(wěn)定PP細胞株，為p21基因