真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型研究.pdf

1、單增李斯特菌是冷卻豬肉中主要病原菌之一，由于此菌具有低溫生長(zhǎng)繁殖的能力和較高的致死率，可能引發(fā)肉品安全問(wèn)題，在國(guó)內(nèi)外食品安全預(yù)防與控制中日愈受到重視。目前，運(yùn)用食品預(yù)測(cè)微生物學(xué)預(yù)測(cè)冷卻豬肉的安全性是提高產(chǎn)品安全監(jiān)控水平的有效措施之一。食品預(yù)測(cè)微生物學(xué)的核心在于建立完善的預(yù)測(cè)模型。國(guó)外對(duì)病原菌的預(yù)測(cè)模型研究起步較早，但大部分的模型主要通過(guò)傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)得到原始數(shù)據(jù)而建立的，該過(guò)程耗時(shí)耗力，且肉中污染的微生物組成復(fù)雜，在研究背景菌存在

2、下某種細(xì)菌模型時(shí)增加了對(duì)靶細(xì)菌計(jì)數(shù)的難度。同時(shí)，肉中微生物菌群之間交互作用的復(fù)雜性及其競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)常在微生物預(yù)測(cè)模型研究中被忽略。因此，本論文以冷卻豬肉中單增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）為研究對(duì)象，首先建立基于DNA和RNA的(RT-)Real-timePCR快速檢測(cè)技術(shù)，選取合適的Real-timePCR法建立冷卻豬肉中單增李斯特菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，并與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法建立的模型進(jìn)行比較，確證此模型應(yīng)用的可行

3、性;在此基礎(chǔ)上運(yùn)用Real-timePCR法研究真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌與乳桿菌的交互生長(zhǎng)模型，探討單增李斯特菌與乳桿菌之間的交互作用。
　　具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.基于DNA和RNA的Real-time(RT-)PCR檢測(cè)冷卻豬肉中單增李斯特菌的研究
　　分別建立冷卻豬肉中單增李斯特菌基于DNA和RNA的Real-time(RT-)PCR快速檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)引物特異性試驗(yàn)、靈敏度試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建、不

4、同人工布菌樣品定量檢測(cè)等步驟，確定在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中不同樣品方法的選擇，為進(jìn)一步豐富單增李斯特菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，加強(qiáng)該病原的控制，以及后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:該方法特異性強(qiáng)，選擇單增李斯特菌hlyA基因的特異性引物對(duì)44種肉中常見(jiàn)的細(xì)菌未見(jiàn)擴(kuò)增;基于DNA和RNA的方法菌液靈敏度分別達(dá)6.33×100cfu·mL-1和6.33×102cfu·mL-1，基于DNA和RNA的方法肉樣靈敏度均為1.39×102cfu·g-1

5、;兩種方法快速便捷，在12h內(nèi)均可完成樣品檢測(cè);通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線可對(duì)人工污染樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，其中基于DNA的Real-timePCR對(duì)未經(jīng)處理的鮮肉樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)，可用于后續(xù)真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌的預(yù)測(cè)模型研究，對(duì)于經(jīng)過(guò)加工處理（如加熱、超高壓等）的肉類食品不適合應(yīng)用上述方法，可采用基于RNA的Real-timeRT-PCR檢測(cè)樣品中單增李斯特菌的活菌水平，但此方法步驟繁瑣，對(duì)試驗(yàn)條件和操作要求較高，且對(duì)于樣品的定量檢測(cè)

6、不是很準(zhǔn)確，只能大概檢測(cè)活菌的污染水平。
　　2.運(yùn)用Real-timePCR法建立冷卻豬肉中單增李斯特菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型
　　將單增李斯特菌接種至冷卻豬肉，運(yùn)用基于DNA的Real-timePCR法建立真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌在不同貯藏溫度（4、10、15、20和25℃）下的初級(jí)生長(zhǎng)模型，包括修正Gompertz、Logistic、Baranyi和Huang模型，在此基礎(chǔ)上利用Rathowsky平方根方程建立二級(jí)模型，

7、將運(yùn)用Real-timePCR法建立的初級(jí)和二級(jí)模型與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)得到的模型進(jìn)行比較，評(píng)估確定該方法建立模型的可行性，為考慮將Real-timePCR法作為一種工具應(yīng)用到預(yù)測(cè)模型提供理論支撐。結(jié)果表明:通過(guò)R2、MSE及F檢驗(yàn)等評(píng)估，修正Gompertz、Logistic、Baranyi和Huang模型均可擬合Real-timePCR法建立真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌的生長(zhǎng)曲線，其中Baranyi模型最有效描述真空包裝冷卻豬肉中單

8、增李斯特菌的生長(zhǎng)，且驗(yàn)證試驗(yàn)得到的Bf值和Af值大部分落在1.0≤Bf≤Af≤1.1的規(guī)定范圍內(nèi)，模型預(yù)測(cè)可靠有效;利用Rathowsky平方根方程建立二級(jí)模型，擬合程度較好，最大生長(zhǎng)速率隨著貯藏溫度的升高而加快(0.03～0.5logcfu·(mL·h)-1），遲滯期隨著貯藏溫度的升高而變短(42～3h)，可用于評(píng)估溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)特性的影響;通過(guò)與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)得到的曲線特征、生長(zhǎng)參數(shù)等比較，運(yùn)用Real-timePCR法建立的模型

9、與傳統(tǒng)模型無(wú)明顯差別，能較好地預(yù)測(cè)單增李斯特菌在冷卻豬肉中的生長(zhǎng)情況，解決了傳統(tǒng)細(xì)菌預(yù)測(cè)模型建立耗時(shí)耗力等問(wèn)題，且可對(duì)在背景細(xì)菌存在下建立某類病原菌的模型更加準(zhǔn)確。
　　3.真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌與乳桿菌交互生長(zhǎng)模型研究
　　接種單增李斯特菌與乳桿菌于同一液體培養(yǎng)體系中，在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，研究?jī)煞N細(xì)菌之間生長(zhǎng)是否產(chǎn)生影響，在此基礎(chǔ)上將乳桿菌與單增李斯特菌分別接種至冷卻豬肉中，真空包裝，放于4℃下貯藏，利用Jame

10、son-effect模型和改良Lotka-Volterra競(jìng)爭(zhēng)模型探討真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌與乳桿菌的交互作用，更全面地考慮模型建立的實(shí)際影響因素，使微生物預(yù)測(cè)模型更好地為生產(chǎn)服務(wù)。結(jié)果表明:當(dāng)單增李斯特菌與乳桿菌共同存在于同一液體培養(yǎng)體系中，兩者之間會(huì)產(chǎn)生交互作用，即乳桿菌對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)有抑制作用，當(dāng)乳桿菌生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期后，單增李斯特菌停止生長(zhǎng)，存在Jameson效應(yīng)，可能是由于乳桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗影響了單

11、增李斯特菌的生長(zhǎng);運(yùn)用Real-timePCR法可從冷卻豬肉中背景細(xì)菌存在下對(duì)靶細(xì)菌識(shí)別并計(jì)數(shù)，可用于建立靶細(xì)菌的生長(zhǎng)模型，利用Baranyi方程擬合曲線的參數(shù)與傳統(tǒng)模型比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了將Real-timePCR法運(yùn)用到預(yù)測(cè)模型中的可行性;利用Jameson-effect模型可擬合真空包裝冷卻豬肉中單增李斯特菌與乳桿菌的生長(zhǎng)曲線，且兩種細(xì)菌生長(zhǎng)幾乎同時(shí)減緩，與純菌接種培養(yǎng)生長(zhǎng)情況不同，可考慮將細(xì)菌交互作用應(yīng)用到預(yù)測(cè)微生物模型中，更合乎