畢赤酵母基因打靶效率改造研究.pdf

1、廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，均在文中以適當(dāng)方式明確標(biāo)明，并符合法律規(guī)范和《廈門大學(xué)研究生學(xué)術(shù)活動(dòng)規(guī)范(試行)》。另外，該學(xué)位論文為(倆守、巷受)課題(組)的研究成果，獲得(伍1守專噎)課題(組)經(jīng)費(fèi)或?qū)嶒?yàn)室的資助，在(嘀守毒虞)實(shí)驗(yàn)室完成。(請(qǐng)?jiān)谝陨侠ㄌ?hào)內(nèi)填寫課題或課題組負(fù)責(zé)人或?qū)嶒?yàn)室名稱，未有此項(xiàng)聲明內(nèi)容的，可以不作特別聲明。

2、)聲明人(簽名)礫藻為；年占月I夕日摘要基因打靶技術(shù)是研究酵母分子生物學(xué)的重要工具，是研究特定基因功能或胞內(nèi)蛋白相互作用的重要手段之一，模式酵母，如釀酒酵母或裂殖酵母，已經(jīng)建立了較為有效的基因打靶系統(tǒng)。然而與模式酵母相比，巴斯德畢赤酵母的基因打靶效率低下，大大限制了其在基礎(chǔ)研究和工業(yè)上的應(yīng)用。鑒于巴斯德畢赤酵母近十年在蛋白表達(dá)和化學(xué)品生產(chǎn)上日益廣泛的應(yīng)用，本研究擬從分子水平改造畢赤酵母菌株，提高其基因打靶效率，以滿足其在基因工程和代謝工

3、程中改造的需求。為達(dá)到上述研究目的，主要采取以下兩個(gè)策略進(jìn)行改造：1)通過提高靶細(xì)胞適應(yīng)性來加強(qiáng)基因打靶效率。以參與巴斯德畢赤酵母GSll5糖基化途徑的OCHl基因敲除為例，首先通過一個(gè)輔助載體在GSll5細(xì)胞中備份表達(dá)OCHl基因，再對(duì)含有輔助載體的GSll5進(jìn)行基因組上OCHl基因的敲除。OCHl基因作為畢赤酵母糖基化途徑的重要基因，其功能的缺失對(duì)細(xì)胞的生長造成很大影響，而通過輔助載體表達(dá)造成的OCHl基因冗余大大彌補(bǔ)了基因組上OC

4、Hl基因缺失菌株的生長缺陷。在使用相同同源臂長度的情況下，與傳統(tǒng)一步法敲除相比，巴斯德畢赤酵母GSll5基因組上OCHl基因的敲除陽性率提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，用相同的策略又對(duì)巴斯德畢赤酵母GSll5基因組上KU70和SGSl基因進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)基因置換效率都得到顯著提高，其中，KU70基因的敲除率提高到2倍，SGSl基因的敲除率提高了23倍。該研究為非傳統(tǒng)酵母提供了頑固基因敲除的有效策略，且表明基因敲除導(dǎo)致的功能缺失以及進(jìn)一步引起的細(xì)

5、胞適應(yīng)性下降是導(dǎo)致單倍體非傳統(tǒng)酵母基因打靶效率低下的重要因素。2)通過特定DNA復(fù)制相關(guān)基因的修飾來提高基因打靶效率?；谕粗亟M的基因打靶效率取決于DNA雙鏈缺口修復(fù)的兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)途徑：同源重組(HR)和非同源重組(NHEJ)。通過對(duì)起始NHEJ途徑的KU70基因與調(diào)節(jié)HR途徑的SRS2和SGSl基因的敲除，得到這三個(gè)基因的敲除突變株，分別進(jìn)行ARGl基因敲除并計(jì)算敲除陽性率，從而評(píng)價(jià)SRS2，KU70和SGSl敲除對(duì)同源重組基因置換效率