豬流感病毒和“豬-禽”流感重配病毒的拯救及其生物學特性的研究.pdf

1、豬流感(Swine Influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)引起豬的一種急性、高度接觸性的呼吸道傳染病。SIV不僅可感染豬，同時也具有感染禽等鳥類和人、馬等其他哺乳動物的能力。而豬可被禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus，AIV)和人流感病毒感染，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”和流感病毒新流行毒株產(chǎn)生的“孵育器”，因而豬是流感病毒“禽-哺乳動物”種間傳播鏈中重要

2、的中間宿主。SIV及豬的這些特征決定了它們在流感病毒種間傳播中具有不可替代的地位，SIV在流感病毒的流行、跨種傳播等方面的研究以及在公共衛(wèi)生上都具有重要意義。本研究利用流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)成功拯救了一株豬流感病毒以及兩株“豬-禽”流感重配病毒，并比較兩株重配病毒與其親本毒之間的毒力差異。這為研究評估“豬-禽”流感重配病毒的風險以及流感病毒跨種傳播提供了一定依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.HIN1亞型豬流感病毒的拯救。

3、>　　 利用流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)成功拯救出了豬流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。將豬流感病毒8個基因節(jié)段經(jīng)RT-PCR合成cDNA后，分別克隆到RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ雙向表達載體pHW2000中，構(gòu)建成8個重組質(zhì)粒。用8個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1細胞，30小時后加入TPCK-胰酶至終濃度0.5μg/mL。共轉(zhuǎn)染48～72 h后收獲COS-1細胞及其上清，經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF

4、雞胚。收獲死亡雞胚尿囊液并繼續(xù)用SPF雞胚傳3代，得到有感染性的病毒。經(jīng)血凝、血凝抑制試驗、測序分析、電鏡觀察等均證實了A/S/TJ/04豬流感病毒的成功拯救，這為進一步研究豬流感病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、流感跨種傳播的機制以及構(gòu)建新型豬流感疫苗株奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.“豬-禽”流感重配病毒的拯救及其生物學特性的研究。
　　 以流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)為工具，分別將豬流感病毒毒株A/S/TJ/04的HA基因以及HA和N

5、A基因用禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)(A/C/HB/04)的相應基因片段進行置換，構(gòu)建了“7+1”型重配病毒T+H(HA)和“6+2”型重配病毒T+H(HA/NA)，并測定親本毒和重配毒的EID50。以BALB/c小鼠為動物實驗模型，各種病毒以106EID50的病毒量對小鼠進行攻毒，觀察小鼠的存活率和體重變化情況，并在攻讀后第3、6、12天取小鼠心、肺、脾、直腸和腦，計算組織體重比(即比重)，利

6、用抗原捕捉ELISA檢測方法檢測各器官的病毒含量。通過對各攻毒組的數(shù)據(jù)進行比較，比較親本毒株和重配毒株對小鼠感染致病能力的差異。結(jié)果顯示，重配毒株對小鼠的致病力介于兩親本毒之間，強于豬流感病毒.A/S/TJ/04而弱于禽流感病毒A/C/HB/04，其中重配毒株T+H(HA/NA)的致病力又強于T+H(HA)。結(jié)果表明豬流感病毒A/S/TJ/04在獲得禽流感病毒A/C/HB/04的HA或HA和NA基因后致病力和組織嗜性都有所增強，在跨種傳