克羅諾桿菌免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法研究.pdf

1、克羅諾桿菌是一種腸桿菌科的食源性致病菌，其感染能夠?qū)е履X膜炎，小腸結(jié)腸炎和敗血癥，致死率為50％-80％,僥幸存活者依然會遭受終生的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥?？肆_諾桿菌主要感染人群為各個年齡階段的免疫力低下人群，尤其以低體重，出生不足月的新生兒為甚。目前通過流行病學(xué)的研究，已經(jīng)將新生兒感染與被污染的嬰幼兒配方奶粉聯(lián)系起來。因此2004年FAO/WHO在日內(nèi)瓦的一次會議中將克羅諾桿菌和沙門氏菌列為嬰幼兒配方奶粉中存在的兩種A類致病菌。目前我國對于克

2、羅諾桿菌的檢測主要依賴于常規(guī)的生理生化檢測方法，該方法步驟繁瑣，耗費(fèi)時間長，至少需要5天才能獲得結(jié)果。此外，這種檢測方法主要是對克羅諾桿菌屬的檢測，而本屬的菌株在自然界中的分布，致病性和毒力均存在著差異，阪崎克羅諾桿菌是分離出來的菌株中數(shù)量最多的，約占本屬的2/3，并且阪崎克羅諾桿菌C.sakazakiiST4在歐洲大陸的爆發(fā)案例中扮演了重要角色。因此有必要發(fā)展快速準(zhǔn)確的克羅諾桿菌乃至阪崎克羅諾桿菌檢測方法。本論文中，主要從以下幾個部分

3、對克羅諾桿菌的快速檢測方法進(jìn)行了研究:
　　(1)抗克羅諾桿菌單鏈抗體scFvH81的構(gòu)建及表達(dá)
　　提取實(shí)驗(yàn)室保存的雜交瘤細(xì)胞RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用通用引物組擴(kuò)增，并選擇符合大小的序列測序。通過IMGT/V-QUEST對這些序列進(jìn)行分析，最終選擇了符合開放閱讀框的H81和L11序列作為構(gòu)建單鏈抗體的重鏈和輕鏈基因。通過SOE-PCR的方法將H81，L11和一個柔性Linker連接起來構(gòu)建為單鏈抗體，并命名為scF

4、vH81。使用包涵體變性復(fù)性的方法制備單鏈抗體，其步驟簡單，過程極短，僅僅需要5天即可制備出大量的單鏈抗體。制備的單鏈抗體具有較好的特異性，其親和力常數(shù)為2.39±0.06×106 M-1。
　　(2)抗克羅諾桿菌單鏈抗體scFvH81生物信息學(xué)分析
　　通過IMGT/V-QUEST分析序列，分析單鏈抗體scFvH81，分析其V(D)J重排機(jī)制，及其胚性基因來源，劃分出單鏈抗體scFvH81可變區(qū)和骨架區(qū)。使用ProtPar

5、amtool分析單鏈抗體scFvH81，其等電點(diǎn)為7.05，因此選擇包涵體的復(fù)性液pH為8.0，有利于單鏈抗體的復(fù)性。使用SOPMA和I-TASSAR預(yù)測單鏈抗體scFvH81的二級結(jié)構(gòu)和3-D模型，并進(jìn)行對接，找到了抗原-抗體結(jié)合界面的關(guān)鍵氨基酸，這些關(guān)鍵氨基酸通常位于二級結(jié)構(gòu)的β轉(zhuǎn)折附近。結(jié)合單鏈抗體3-D模型空間結(jié)構(gòu)并錯開其關(guān)鍵氨基酸引入二硫鍵，以減少對單鏈抗體scFvH81活性的影響，但單鏈抗體scFvH81特異性發(fā)生變化，這證

6、明二硫鍵的引入還需要考慮其他因素的影響。
　　(3)克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)的篩選及其PCR檢測方法的建立
　　以阪崎克羅諾桿菌C.sakazakii ATCC BAA-894基因組序列為模板，使用生物信息學(xué)對克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)進(jìn)行了篩選，共篩選出了22個特異性靶點(diǎn)，根據(jù)這些特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，最終獲得了一對特異性引物N2。以該對引物為基礎(chǔ)建立具有較好的抗干擾能力的PCR檢測方法，其純茵培養(yǎng)物檢測限為102 CFU/mL

7、;基因組DNA檢測限為128 fg/μL。該檢測方法在人工污染實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過8h的培養(yǎng)，可以檢測出人工污染奶粉中接種量為3.5×100 CFU的克羅諾桿菌。
　　(4)阪崎克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)的篩選及其PCR檢測方法的建立
　　以阪崎克羅諾桿菌C.sakazakii ATCC BAA-894基因組序列為模板，使用生物信息學(xué)工具，篩選出了38組阪崎克羅諾桿菌特異性靶點(diǎn)，以這些特異性靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，篩選出來了3對特異性引物（CS14，

8、CS21和CS38）并建立了具有較好的抗干擾能力的PCR檢測方法，其基因組靈敏度分別為1.35 pg/μL，135 fg/μL，和135 fg/μL;其純菌培養(yǎng)物靈敏度為5.5×105 CFU/mL，5.5×103 CFU/mL，5.5×103 CFU/mL。經(jīng)過8h的預(yù)培養(yǎng)，引物對CS21和CS38在人工污染奶粉中的檢測限為5.5×10-1CFU/10g。
　　(5)阪崎克羅諾桿菌種熒光定量PCR檢測方法的建立
　　本研究