利多卡因抑制膿毒癥大鼠HMGB1表達(dá).pdf

1、一、研究背景:
　　 膿毒癥是由嚴(yán)重的感染、燒傷、創(chuàng)傷、休克、外科大手術(shù)等引發(fā)的一種全身性炎癥反應(yīng)綜合癥，也是誘發(fā)多器官功能衰竭(multiple organ system failure，MOSF)、膿毒癥休克最重要的原因。雖然抗生素的廣泛應(yīng)用大幅度降低了膿毒癥的死亡率，但近30年，膿毒癥的發(fā)病率和因膿毒癥死亡病例的絕對(duì)數(shù)字仍呈明顯的上升趨勢(shì)，膿毒癥仍然是ICU病人死亡的主要原因。據(jù)報(bào)道，全球范圍內(nèi)膿毒癥的病死率約為20％，即

2、每天約有1400人死于膿毒癥。我國(guó)危重病患者膿毒癥發(fā)病率約為15.7％，病死率更是高達(dá)30.6％。因此，膿毒癥已成為繼心血管疾病、癌癥之后威脅人類(lèi)健康的第三位疾病。為此，危重醫(yī)學(xué)界共同呼吁采取措施降低膿毒癥的病死率。
　　 研究表明，高遷移率族蛋白(high mobility group box1，HMGB1；high mobilitygroup protein1，HMG-1；amphoterin)在膿毒癥的致死過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵

3、性炎性因子作用。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)攻擊后8～12小時(shí)RAW264.7細(xì)胞開(kāi)始釋放HMGB1，釋放時(shí)間至少可持續(xù)72小時(shí)。而腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的HMGB1釋放可持續(xù)達(dá)96小時(shí)，甚至更長(zhǎng)。壞死的組織細(xì)胞，甚至凋亡細(xì)胞也可將內(nèi)含的HMGB1釋放至細(xì)胞外。HMGB1一旦進(jìn)入組織間隙，即可表現(xiàn)出其炎癥因子的作用。HMGB1可通過(guò)自身毒性作用、刺激其他促炎因子釋放、導(dǎo)致凝血、纖溶系統(tǒng)功能紊亂、破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整

4、性、擾亂免疫系統(tǒng)功能、破壞腸黏膜屏障的完整性等多種途徑參與或加重膿毒癥的致病過(guò)程。研究表明，即使在致病因素作用后24小時(shí)使用抗HMGB1抗體、HMGB1的A盒或丙酮酸等針對(duì)HMGB1進(jìn)行處理，均可顯著提高膿毒癥動(dòng)物的生存率。正是由于HMGB1延遲合成與分泌的特點(diǎn)及其廣泛的致病作用，HMGB1被認(rèn)為是膿毒癥致病的關(guān)鍵性因子，并可能為膿毒癥的治療帶來(lái)新的突破。
　　 已有的研究顯示，利多卡因可作用于炎癥反應(yīng)的多個(gè)方面，對(duì)炎癥過(guò)程發(fā)揮

5、調(diào)節(jié)作用。特別是其對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)作用的存在，吸引研究者在多種疾病及其模型上對(duì)利多卡因的治療作用進(jìn)行試驗(yàn)性研究，并取得較好的治療效果。利多卡因凝膠可使?jié)冃灾苯Y(jié)腸炎患者臨床癥狀明顯改善，腸道組織學(xué)改變亦有顯著的減輕。利多卡因膀胱沖洗可顯著改善間質(zhì)性膀胱炎患者膀胱間質(zhì)的水腫，促進(jìn)膀胱壁潰瘍的愈合，改善臨床癥狀。利多卡因還可顯著降低燒傷病人血清炎性因子的水平，同時(shí)病人疼痛程度也明顯減輕。在心、肝、腎缺血再灌注損傷、高氧或內(nèi)毒素肺損傷研究中也有

6、類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，提前1小時(shí)開(kāi)始連續(xù)3小時(shí)的利多卡因靜脈輸注可顯著降低動(dòng)物病死率。另一項(xiàng)CLP小鼠膿毒癥模研究中，預(yù)先使用微量滲透泵連續(xù)皮下輸注利多卡因也有類(lèi)似的結(jié)果。多數(shù)報(bào)道認(rèn)為，利多卡因的抗炎作用與其下調(diào)NF-κB，抑制TNF-α，IL-1β等早期炎癥因子有關(guān)。但是，利多卡因抗炎/抗膿毒癥作用與HMGB1的關(guān)系尚明確。
　　 RAW264.7細(xì)胞是小鼠單核巨噬細(xì)胞株。研究發(fā)現(xiàn)，LPS或IFN-γ刺激下R

7、AW264.7細(xì)胞分泌HMGB1的水平與人外周血單核細(xì)胞相似。因此，本研究我們首先以RAW264.7細(xì)胞為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平觀察利多卡因?qū)PS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1釋放的影響。然后，以Wistar大鼠為研究對(duì)照，使用盲腸結(jié)扎穿孔的方法制作膿毒癥動(dòng)物模型，并將不同劑量的利多卡因(5，10，20mg/kg)在CLP后0，1，2小時(shí)腹腔內(nèi)注射，觀察利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠肝、腎組織內(nèi)HMGB1表達(dá)的影響，進(jìn)一步在動(dòng)物整體水平探討

8、利多卡因抗炎/抗膿毒癥的機(jī)制。最后直接采用純化重組HMGB1制作動(dòng)物模型，觀察利多卡因在整體動(dòng)物水平和器官水平對(duì)HMGB1直接致?lián)p動(dòng)物的保護(hù)作用。
　　 二、方法
　　 1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：RAW264.7細(xì)胞以5×106個(gè)/ml的密度種植在96孔組織培養(yǎng)板中。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，分為5組，每組5孔。具體操作：除去含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)液，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3遍，(1)陰性對(duì)照組(C組)僅加入無(wú)血清的R

9、PMI1640培養(yǎng)液1ml；(2)陽(yáng)性對(duì)照組(LPS組)加入內(nèi)含100ng/ml LPS的無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液1ml；(3)利多卡因1組加入內(nèi)含2μg/ml利多卡因和100ng/ml LPS復(fù)合液1ml；(4)利多卡因2組加入內(nèi)含20μg/ml利多卡因+100ng/ml LPS復(fù)合液1ml；(5)利多卡因3組加入內(nèi)含200μg/ml利多卡因+100ng/ml LPS復(fù)合液1ml。5組細(xì)胞均于孵育箱中培養(yǎng)24h后收取培養(yǎng)上清和

10、細(xì)胞。ELISA測(cè)定上清液HMGB1水平，PCR測(cè)定細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA表達(dá)，ActiveMotif NF-κB家族試劑盒測(cè)定NF-κB。
　　 2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：2％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉動(dòng)物。假手術(shù)組(Sham組，n=15)打開(kāi)腹腔后縫合，其他各組制作盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥模型。術(shù)后0、1、2小時(shí)Sham組和生理鹽水處理組(NS組，n=20)分別腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml，利多卡因各組(n=15)分

11、別注射利多卡因5、10和20mg/kg(用生理鹽水稀釋至0.5ml)。24小時(shí)后過(guò)量麻醉劑處死動(dòng)物，留取血液和器官標(biāo)本。實(shí)時(shí)PCR測(cè)定器官HMGB1 mRNA表達(dá)，免疫組化檢測(cè)定器官NF-κB p65，光學(xué)多顯微鏡檢查組織病理變化，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿ALT、Cr，ELISA測(cè)定肺MPO和小腸MDO。另取100只動(dòng)物分4組進(jìn)行7天生存率觀察，制作Kaplan-Meier生存率曲線，Log-rank法進(jìn)行生存率比較。
　　 3

12、：HMGB1直接損傷實(shí)驗(yàn)C3H/HeJ小鼠30只，分3組(n=10)：對(duì)照組(C組)、HMGB1組(H組)和利多卡因組(L組)。2％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉動(dòng)物。C組腹腔注射生理鹽水1ml；H組，腹腔內(nèi)注射高純度人工重組HMGB1(rHMBG-1)500μg/1ml；L組接受H處理后0、1、2小時(shí)腹腔內(nèi)利多卡因20mg/kg(用生理鹽水稀釋至0.5ml)。進(jìn)行生存率觀察。另取C3H/HeJ小鼠30只，分3組(n=10)：對(duì)

13、照組(C組)、HMGB1組(H組)和利多卡因組(L組)。2％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉動(dòng)物。C組氣管內(nèi)注射生理鹽水50μl；H組氣管內(nèi)注射rHMBG-1100μg/50μl；L組接受H處理后0、1、2小時(shí)腹腔內(nèi)利多卡因20mg/kg。觀察氣管灌洗液中性粒細(xì)胞比和蛋白含量、肺濕干重比、肺組織MPO活性、肺組織TNF-a水平、NF-κB蛋白含量和肺病理改變。
　　 4：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：組間比較使用多參數(shù)單因素方差分析(Hol

14、m-Sidak method)檢驗(yàn)。生存率比較Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行。數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包或SigmaPlot11.0處理并作圖。P<0.05，認(rèn)為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、結(jié)果
　　 1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：ELISA顯示，利多卡因處理可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1的釋放，且呈明顯劑量依賴(lài)性。與LPS組(3.18±0.527 ng/ml)比較，利多卡因20、200μg/ml組上清液HMGB1

15、水平(1.81±0.391 ng/ml，1.66±0.238 ng/ml)明顯降低(t=4.640；t=5.148，P<0.001)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，正常培養(yǎng)組RAW264.7細(xì)胞胞漿內(nèi)沒(méi)有HMGB1特異性染色或淡染；LPS刺激可使巨噬細(xì)胞體積增大，偽足伸出，部分細(xì)胞胞核染色變藍(lán)，胞漿HMGB1特異性染色加深；利多卡因組細(xì)胞體積和形態(tài)改變不明顯，部分細(xì)胞HMGB1的釋放被抑制，胞漿內(nèi)HMGB1特異性染色淺。PCR觀察到利多卡因抑制細(xì)胞

16、內(nèi)HMGB1mRNA表達(dá)，與LPS組(44.44±5.82ng/ml)比較，利多卡因20μg/ml組(27.91±6.88ng/ml)、利多卡因200μg/ml組(19.34±2.71ng/ml)組HMGB1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(t=4.489，P=0.001；t=5.784，P<0.01)。同時(shí)，利多卡因處理也可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB活性增強(qiáng)(P<0.05)。
　　 2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　

17、　 1)提高動(dòng)物生存率：CLP術(shù)后12小時(shí)開(kāi)始部分動(dòng)物活動(dòng)減少，不能自潔；嗜睡，對(duì)外界環(huán)境改變失去興趣；豎毛；飲水減少。隨著的時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促、腹瀉；甚至仰臥；死亡。表現(xiàn)膿毒癥模型復(fù)制成功。CLP術(shù)后第5天生理鹽水組(NS)膿毒癥大鼠全部死亡(n=25)，利多卡因5、10、20 mg/kg處理組術(shù)后第7天仍有部分動(dòng)物存活。Log-rank分析顯示，利多卡因5，10，20mg/kg組大鼠生存率與生理鹽水組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

18、的差異(X2=5.472，P=0.19；X2=12.859，P<0.001；X2=26.237，P<0.001)。X2
　　 2)改善器官功能：CLP各組術(shù)后24小時(shí)ALT水平較假手術(shù)組(41.60±7.89U/l))升高(P<0.05)。利多卡因10、20 mg/kg處理組(71.20±8.76 U/l，58.00±10.37U/l)與NS組(92.00±13.38U/l)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(t=3.162，P=0.005

19、；t=5.168；P<0.001)。CLP各組術(shù)后24小時(shí)血Cr水平較假手術(shù)組(20.40±5.32μmol/l))升高(P<0.05)。利多卡因5、10、20 mg/kg處理組(44.80±3.7μmol/l，34.80±4.44μmol/l，27.40±2.30μmol/l)大鼠術(shù)后24小時(shí)血Cr水平較生理鹽水組(51.00±5.00μmol/l)降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.285，P=0.033；t=5.971，P<0.00

20、1；t=8.699，P<0.001)。CLP各組術(shù)后24小時(shí)肺組織MPO活性較假手術(shù)組(4.602±0.719)升高(P<0.05)。利多卡因10、20 mg/kg處理組(6.854±0.248，6.327±0.321)與NS組(8.945±0.317)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(t=8.099，P<0.001；t=10.143，P<0.001)。CLP各組術(shù)后24小時(shí)回腸組織DAO水平較假手術(shù)組(0.849±0.113)降低(P<0.05

21、)。利多卡因10、20 mg/kg處理組(0.418±0.066，0.521±0.048)與NS組(0.192±0.052)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(t=5.136，P<0.001；t=7.466，P<0.001)。
　　 3)減輕組織病理?yè)p傷：CLP24小時(shí)肝、腎、肺和小腸出現(xiàn)廣泛的組織學(xué)損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，利多卡因(20mg/kg)處理可明顯減輕組織學(xué)損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 4)抑制器官HMGB1過(guò)表達(dá)和NF-κB

22、活化；實(shí)時(shí)PCR和免疫組化顯示，利多卡因可劑量依賴(lài)性的抑制CLP誘導(dǎo)的肝、腎、肺和小腸組織HMGB1mRNA的過(guò)表達(dá)和NF-κB的活化。
　　 3：HMGB1直接損傷實(shí)驗(yàn)rHMBG1500μg腹腔內(nèi)注射2小時(shí)內(nèi)動(dòng)物出現(xiàn)明顯的內(nèi)毒素血癥樣表現(xiàn)，48小時(shí)動(dòng)物80％死亡，利多卡因處理組死亡率為20％。Log-rank分析顯示，利多卡因處理可顯著提高大鼠生存率(X2=4.736，P=0.03)。在rHMBG1100μg急性肺損傷實(shí)驗(yàn)觀察

23、到：與對(duì)照組比較，HMGB1組、利多卡因組支氣管灌洗液中性粒細(xì)胞比和蛋白含量顯著增加，肺組織濕干重比、肺髓過(guò)氧化物酶活性、NF-κB和TNF-a蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與HMGB1組比較，利多卡因處理組上述指標(biāo)均明顯降低(P<0.05)。
　　 四、結(jié)論
　　 利多卡因抗炎/抗膿毒癥作用可能與其抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞HMGB1mRNA合成、轉(zhuǎn)位與釋放，調(diào)節(jié)NF-κB活化有關(guān)；利多卡因腹腔內(nèi)注射可抑制CL