二十二碳六烯酸抑制炎癥及內質網應激改善肺血管重塑.pdf

1、目的:肺高壓(PH)是肺血管阻力持續(xù)升高，右心室負荷不斷增加，進而導致進行性右心衰竭甚至死亡的常見嚴重并發(fā)癥。近年來研究認為肺血管炎癥及血管細胞內質網應激反應在PH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。二十二碳六烯酸(DHA)是n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)的主要成分，具有調節(jié)內質網應激及抗炎等效應。我們前期研究發(fā)現(xiàn)DHA能改善低氧性肺動脈高壓。本研究擬采用野百合堿(MCT)誘導的大鼠肺高壓模型，進一步探討DHA的防治肺高壓作用及其機制。<

2、br>　　方法:
　　1.實驗動物分組:SD(200-250g)大鼠40只，每組10只，隨機分為4組:對照組（生理鹽水注射），MCT造模組（腹腔單次注射MCT，4周），MCT造模組+DHA灌胃預防組（腹腔注射MCT當天即給予DHA灌胃，持續(xù)4周），MCT造模+DHA治療組（腹腔注射MCT兩周后給予DHA每天灌胃，持續(xù)2周）。
　　(1)右心導管法檢測各組大鼠肺動脈平均壓;沿室間隔分離右心室(RV)，左室+室間隔(LV+S)分

3、別稱取質量，計算右心室肥厚指數(shù):RV/(LV+S);(2)實時定量PCR檢測肺組織細胞因子IL6，TNF-α，MCP-1及IL1β基因表達;(3)免疫組化法檢測①肺動脈中膜厚度②肺組織及阻力性肺動脈周圍CD3+T細胞及CD68+巨噬細胞計數(shù);(4)免疫印跡法檢測肺組織內質網應激相關蛋白表達水平;(5)免疫熒光雙染檢測內質網應激相關蛋白在肺組織中膜的表達差異。
　　2.組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMC)并進行免疫熒光

4、細胞鑒定。
　　(1)免疫印跡及細胞免疫熒光檢測PASMC內質網應激蛋白表達水平;(2)實時定量PCR檢測PASMC的NFATc l-4基因表達水平;(3)免疫印跡檢測NFATc1的總蛋白水平及核轉移情況;(4) CCK8及BrdU攝入檢測PASMC增殖;(5)流式細胞術檢測PASMC細胞周期;(6)免疫印跡檢測細胞周期相關蛋白表達水平。
　　結果:
　　1.與對照組大鼠相比，MCT組大鼠4周后平均肺動脈壓顯著升高(M

5、CT:48.2+3.1mmHg vs control:20.5±1.3mmHg;p＜0.05);DHA預防及治療可顯著降低MCT誘導的PH大鼠平均肺動脈壓（MCT+DHA預防組:25.3+2.1mmHg; MCT+DHA治療組:31.5+3.4mmHg; p＜0.05vs MCT組）及右心指數(shù)（MCT+DHA預防組:0.37±0.02; MCT+DHA治療組:0.42±0.01; p＜0.05 vs MCT組）;并顯著抑制MCT誘導的大

6、鼠肺動脈中膜增厚。
　　2.DHA預防及治療可顯著減少MCT誘導的大鼠肺組織IL1β，TNFα，IL-6和MCP-1基因表達(p值均＜0.05);并抑制MCT誘導的大鼠肺組織及肺血管周圍CD3+T細胞及CD68+巨噬細胞的聚集。
　　3.DHA預防及治療可顯著減少MCT誘導的大鼠肺組織內質網應激相關蛋白p-IRE1，PDI和GRP78蛋白表達（p值均＜0.05）;免疫熒光雙染表明DHA主要減少肺動脈平滑肌層PDI的表達。

7、r>　　4.在培養(yǎng)的PASMC，PDGF-BB刺激能顯著增加內質網應激相關蛋白p-IRE1，PDI和GRP78蛋白表達（p值均＜0.05）而DHA預孵能抑制PDGF-BB誘導的內質網應激相關蛋白的表達;免疫熒光表明PDGF-BB刺激PASMC后PDI熒光信號增強，而預孵DHA能減弱熒光信號。
　　5.PDGF-BB刺激能誘導PASMC的NFATc1，NFATc2及NFATc3基因表達增加(p＜0.05 vs對照組)而對NFATc4

8、無顯著影響;預孵DHA能逆轉PDGF-BB誘導的NFATc1及NFATc2的基因表達，而對NFATc3無顯著影響。
　　6.PDGF-BB刺激能誘導PASMC的NFATc1總蛋白表達增加，蛋白核轉移增多，而預孵DHA及內質網應激抑制劑4-PBA能產生類似的抑制PDGF-BB誘導性NFATc1總蛋白表達增加及活性增強。
　　7.PDGF-BB刺激PASMC能顯著促進細胞周期蛋白cyclin D1表達，抑制G1期相關負性蛋白p2

9、1和p27表達，處于細胞周期S期百分比增多，細胞增殖增加;而DHA預孵或NFATc1 siRNA干擾能產生類似的抑制PDGF-BB誘導的cyclin D1表達增加，恢復p21和p27的蛋白水平，將細胞阻滯于G1期，抑制PDGF-BB誘導的PASMC的增殖。
　　結論:
　　1.DHA抑制MCT誘導的PH的肺組織及肺血管周圍炎癥反應。
　　2.DHA抑制PDGF-BB誘導的PASMC內質網應激，減少PASMC增殖，改善肺