表皮生長因子受體抑制劑對大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的作用機制研究.pdf

1、第一部分表皮生長因子受體抑制劑AG1478對大鼠脊髓損傷后GAP-43的表達及運動功能缺損的影響
　　目的：脊髓損傷后膠質瘢痕的形成及髓鞘相關抑制分子的產生是導致軸突不能有效再生的重要原因。而表皮生長因子受體的活化可導致靜息星形膠質細胞反應性增生并形成膠質瘢痕，而且表皮生長因子受體抑制劑AG1478通過減輕髓鞘相關抑制分子及硫酸軟骨素蛋白聚糖對軸突再生的抑制作用而促進了視神經(jīng)軸突的再生，因此表皮生長因子受體抑制劑AG1478可能

2、對脊髓損傷后軸突的再生有促進作用而改善脊髓損傷所導致的神經(jīng)功能缺損。在本實驗中我們通過在損傷脊髓局部給予表皮生長因子受體抑制劑AG1478以觀察AG1478能否上調相關生長蛋白-43（GAP-43）的表達及其是否改善大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能缺損癥狀。
　　 方法：應用重物墜落打擊法建立大鼠脊髓損傷模型, 假手術組僅切除T10椎板。48只健康雌性成年SD大鼠隨機分為假手術組、損傷對照組和AG1478治療組。AG1478治療組大鼠在脊

3、髓損傷后立即在局部給予含有0.2 ml 2mM的AG1478的明膠海綿外敷治療，而損傷對照組和假手術均在術后立即給予含溶劑（二甲基亞砜）的明膠海綿外敷作對照治療。應用免疫熒光技術和western blot檢測各組大鼠脊髓損傷后28天損傷區(qū)域生長相關蛋白-43(GAP-43)的表達情況。應用BBB評分法對大鼠脊髓損傷后第1d及以后每周（共8周）后肢運動功能進行評分。在損傷前及損傷后每周（共8周）測量各組大鼠體重。
　　 結果：免疫

4、熒光檢測顯示在損傷后28天AG1478組GAP-43陽性細胞計數(shù)表達較對照組明顯增多(P＜0.01)。Western blot印跡分析也顯示AG1478組GAP-43表達較對照組明顯上調(P＜0.01)。損傷對照組與AG1478治療組大鼠在傷后第1天后肢均幾乎完全癱瘓,表明兩組大鼠損傷程度一致。經(jīng)重復測量數(shù)據(jù)方差分析檢驗后顯示AG1478組BBB評分明顯高于對照組(P<0.01)。經(jīng)重復測量數(shù)據(jù)方差檢驗分析顯示AG1478組大鼠體重明顯

5、重于對照組大鼠體重(P＜0.05)。
　　 結論：脊髓損傷后立即在損傷局部給予表皮生長因子受體抑制劑AG1478干預，可以改善大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)功能缺損并明顯上調與軸突生長相關的GAP-43。表皮生長因子受體抑制劑AG1478對脊髓損傷有確切的治療作用，這提示其可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的有效保護劑。
　　 第二部分表皮生長因子受體抑制劑AG1478對大鼠脊髓損傷后反應性星形膠質活化增生的影響
　　 目的：星形膠質

6、增生被認為在脊髓損傷的病理生理改變中起著極其重要的作用，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理生理改變中星形膠質細胞的增生與表皮生長因子受體的活化密切相關。因此我們試圖應用表皮生長因子受體抑制劑AG1478對脊髓損傷進行干預以觀察表皮生長因子受體抑制劑AG1478對脊髓損傷后星形膠質細胞上磷酸化表皮生長因子受體（Pegfr）的表達和反應性膠質增生及軸突生長抑制因子硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）產生的影響方法：應用重物墜落打擊法建立大鼠脊髓損傷模型

7、, 假手術組僅切除T10椎板。45只健康雌性成年SD大鼠隨機分為假手術組、損傷對照組和AG1478治療組。AG1478治療組大鼠在脊髓損傷后立即在局部給予含有0.2 ml 2mM的AG1478的明膠海綿外敷治療，而損傷對照組和假手術均在術后立即給予含溶劑（二甲基亞砜）的明膠海綿外敷作對照治療。分別于損傷后14d、28d處死各組實驗大鼠。應用免疫熒光技術和western blot技術檢測GFAP在損傷后14天、28天的表達水平變化情況；采

8、用免疫熒光雙標技術檢測脊髓損傷后14天各組大鼠星形膠質細胞表達磷酸化表皮生長因子受體（Pegfr）的情況并檢測傷后28天時星形膠質細胞表達硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）的情況。
　　 結果：假手術組GFAP陽性細胞稀少，形態(tài)纖細；而損傷對照組在傷后14天GFAP表達明顯上調，星形膠質細胞呈突觸增多變大的活化狀態(tài)，傷后28天典型膠質瘢痕出現(xiàn)；在AG1478治療組GFAP的表達明顯受到抑制，而傷后28天無明顯膠質瘢痕形成。GFAP

9、 Western印跡分析也顯示在損傷后14天和28天，AG1478組GFAP的表達均明顯低于對照組假手術組(P＜0.01)。假手術組Pegfr和GFAP表達均很弱，無熒光染色雙標陽性區(qū)域，表明正常脊髓組織的星形膠質細胞不表達Pegfr。對照組Pegfr和GFAP均有強表達，同時損傷組脊髓組織病灶周圍存在明顯空洞和疤痕改變，且在空洞周圍疤痕存在Pegfr和GFAP雙標陽性區(qū)域，表明脊髓損傷后星形膠質細胞表達Pegfr，然而AG1478組P

10、egfr和GFAP的表達均較弱，其熒光強度較對照組明顯較弱（P＜0.01），且無Pegfr和GFAP雙標陽性區(qū)域,表明AG1478對Pegfr和GFAP的表達均有明顯抑制作用。假手術組脊髓組織CSPGs和GFAP表達均較弱；而對照組CSPGs和GFAP均有較強表達，且損傷中心CSPGs表達很強，在膠質瘢痕區(qū)域CSPGs和GFAP存在明顯雙標陽性區(qū)域，表明活化星形膠質細胞大量表達CSPGs；在AG1478組脊髓組織中CSPGs和GFAP的

11、熒光強度均明顯低于照組（P＜0.01），這表明AG1478能明顯抑制CSPGs和GFAP的表達。
　　 結論：脊髓損傷后星形膠質細胞明顯上調Pegfr的表達，而表皮生長因子受體抑制劑AG1478通過對星形膠質細胞上Pegfr活化的抑制而導致其對脊髓損傷后反應性星形膠質增生及抑制因子CSPGs有明顯抑制作用。
　　 第三部分表皮生長因子受體抑制劑AG1478對大鼠脊髓損傷后髓鞘脫失及髓鞘相關抑制因子表達的影響
　　

12、 目的：外傷性脊髓損傷不僅造成神經(jīng)元及軸突嚴重損傷而且導致少突膠質細胞受到嚴重傷害，而少突膠質細胞和軸突損害最終導致脊髓髓鞘的大量脫失。同時少突膠質細胞損傷后會釋放大量髓鞘相關抑制分子，這些抑制分子對脊髓損傷后軸突的再生產生極其不利的影響。而表皮生長因子受體抑制劑AG1478對脊髓損傷有良好的治療作用，故我們試圖應用表皮生長因子受體抑制劑AG1478干預脊髓損傷以觀察AG1478對大鼠脊髓損傷后髓鞘脫失及髓鞘相關抑制因子MAG、Nogo

13、-A和Omgp Mrna表達的影響。
　　 方法：將33只健康雌性成年SD大鼠隨機分為損傷對照組（重物墜落打擊法建立脊髓損傷模型后立即在損傷局部給予含二甲基亞砜的明膠海綿外敷作對照治療），AG1478治療組（重物墜落打擊法建立模型后立即在損傷局部給予含有0.2 ml 2mM的AG1478的明膠海綿外敷治療）和假手術組（只切除椎板并立即在損傷局部給予含二甲基亞砜的明膠海綿外敷作對照治療）。各組大鼠均在脊髓損傷后14和28天處死。應

14、用勒克司堅牢藍染色（Luxol Fast Blue）方法分析各組大鼠脊髓損傷后28天髓鞘脫失情況。利用RT-PCR方法檢測各組大鼠脊髓損傷后14天、28天髓鞘相關抑制因子MAG、Nogo-A和Omgp Mrna表達的情況。
　　 結果：在假手術組大鼠脊髓切片Luxol Fast Blue 染色中，脊髓組織呈均勻的亮藍色；而在對照組中損傷部位不能正常著色，這提示病灶中心髓鞘嚴重脫失；而在AG1478治療組中脊髓組織切片不能正常著色

15、的范圍明顯縮小，其髓鞘脫失面積明顯小于對照組（P＜0.01）。而髓鞘相關抑制分子MAG、Nogo-A和Omgp Mrna在假手術組有較弱的表達；在損傷對照組，脊髓損傷后14天及28天髓鞘相關抑制分子的表達均明顯增加；而在AG1478組，脊髓損傷后14天及28天髓鞘相關抑制分子的表達均明顯低于對照組（P<0.01)。
　　 結論：局部應用表皮生長因子受體抑制劑AG1478可改善大鼠脊髓損傷后髓鞘的脫失并能減少大鼠脊髓損傷后髓鞘相關