西施舌精子冷凍保存及其冷凍損傷機(jī)理研究.pdf

1、本文采用流式細(xì)胞術(shù)和顯微術(shù)的方法,研究流式細(xì)胞術(shù)用于評(píng)價(jià)西施舌(Coelomactra antiquata)精子質(zhì)量的可行性、西施舌精子的超低溫冷凍保存技術(shù)以及冷凍損傷機(jī)制,旨在建立一套成熟的西施舌精子超低溫冷凍保存技術(shù),為西施舌的人工育苗和遺傳育種等研究提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:
　　 采用伊紅拒染法和PI拒染法,借助光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行兩種方法的相關(guān)性研究和精密性比較,從而探討流式細(xì)胞術(shù)用于評(píng)價(jià)西施舌凍

2、融精子成活率的可行性。結(jié)果表明伊紅拒染法和PI拒染法呈顯著正相關(guān)(r=0.954,P=0.003),兩種方法均能有效檢測(cè)西施舌精子的成活率,且相關(guān)性很好,但是PI-流式細(xì)胞術(shù)的精密性(CV為2.39％)要優(yōu)于伊紅拒染法實(shí)驗(yàn)(CV為4.67％),故流式細(xì)胞術(shù)適用于西施舌精子成活率的檢測(cè)。
　　 采用流式細(xì)胞術(shù),以質(zhì)膜完整率即成活率為精子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),研究抗凍劑,預(yù)凍速率和冷凍速率對(duì)西施舌精子超低溫冷凍保存的影響。以一定的降溫程序進(jìn)

3、行西施舌精子的超低溫保存,研究二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PG)三種抗凍劑分別在1％、2.5％、4％、5％、10％、15％和20％時(shí)對(duì)西施舌精子質(zhì)膜完整性及成活率的影響,結(jié)果僅4％、10％DMSO,2.5％、5％、15％EG和20％PG被選出用于預(yù)凍速率和冷凍速率的篩選。預(yù)凍速率分析以下5個(gè)速率:①1℃/min；②4℃/min；③6℃/min；④8℃/min⑤20±1℃10min,采用4℃/min的預(yù)凍速率可獲得最佳

4、的超低溫冷凍效果,被用于冷凍速率的篩選。冷凍速率設(shè)置5個(gè)梯度:①0.25℃/min；②0.5℃/min；③1℃/min；④4℃/min,⑤直接投入液氮。35℃水浴解凍,流式細(xì)胞儀分析禹精子質(zhì)膜完整性及成活率,以及進(jìn)行人工受精驗(yàn)證,得出以15％EG為抗凍劑,4℃/min為預(yù)凍速率,4℃/min為冷凍速率,可獲得最佳的成活率和受精率,分別為95.53％和52.32％。
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)研究DMSO、EG和PG三種抗凍劑對(duì)西施舌凍

5、融精子質(zhì)膜完整性、細(xì)胞凋亡狀況以及線粒體功能狀態(tài)的影響,進(jìn)而評(píng)價(jià)不同抗凍劑對(duì)西施舌凍融精子質(zhì)量的影響,從而研究超低溫冷凍保存對(duì)西施舌精子的冷凍損傷機(jī)理。結(jié)果表明,DMSO、EG、和PG三種抗凍劑對(duì)維持凍融精子的質(zhì)膜完整性起到較好的作用,在一定程度上促進(jìn)了凍融精子的凋亡進(jìn)程,且不同抗凍劑及不同濃度的抗凍液對(duì)西施舌精子質(zhì)膜完整性和細(xì)胞凋亡的影響不同,15％EG作為抗凍液,得到凍融精子的質(zhì)膜完整率最高,早期凋亡率最低,分別為80.54％和7.

6、99％；而且超低溫冷凍保存過程降低了西施舌精子的線粒體活性,DMSO、EG和PG三種抗凍劑對(duì)維持西施舌凍精的線粒體活性起到了較好的保護(hù)作用,15％EG處理組的壞死精子比例最低,有線粒體功能的活性精子比例最高,分別為15.04％和81.32％。
　　 采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡分析比較超低溫保存前后西施舌精子的外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化；并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)行超低溫冷凍損傷機(jī)理的研究。結(jié)果表明,掃描電鏡下,西施舌凍融精子的頂