SLXL1、SLX2和SXLR5C及線粒體在生殖細胞中的定位和功能研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個復雜的細胞分化過程,它是所有動物有性繁殖所必需的。該過程主要包括三個階段:精原細胞的有絲分裂階段,精母細胞的減數(shù)分裂階段和圓形精子變態(tài)生成延長型精子的階段。從分子水平上看,精子發(fā)生是一系列特定基因程序性表達和轉(zhuǎn)錄的過程。然而,迄今為止從分子水平上理解哺乳動物精子的發(fā)生過程十分有限。Slx-Like1(Slxl1),Scp3-like,X-linked,2(Slx2)和X-linked,lymphocyte-regulate

2、dcomplex,5c(Xlr5c)是3個新發(fā)現(xiàn)的基因,有關(guān)它們的定位和功能目前還是空白。本文利用細胞生物學技術(shù)、發(fā)育生物學技術(shù)、分子生物學技術(shù)、RNA干涉技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等手段研究這3個基因或蛋白在組織中的定位和功能,特別是在精子發(fā)生和減數(shù)分裂過程中所起的作用。本研究不僅有助于揭示精子發(fā)生的機理和減數(shù)分裂的調(diào)控機制;還可以幫助我們深入了解雄性不育的發(fā)生機制,為不育癥的治療和避孕藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 線粒體所產(chǎn)生的AT

3、P是哺乳動物細胞獲得能量的主要來源。目前,對線粒體的分布、結(jié)構(gòu)和功能的研究已經(jīng)成為細胞生物學研究的熱點。然而,線粒體在水牛生殖細胞中的定位、分布和功能鮮有文獻報道。本文研究活性線粒體在水牛顆粒細胞、精子細胞、卵母細胞和早期胚胎發(fā)育過程中的凋亡、定位和位移變化趨勢。本研究不僅有助于揭示顆粒細胞凋亡和卵巢閉鎖的關(guān)系,還有助于進一步揭示水牛卵子成熟的機制;同時本研究建立了一種評價卵子發(fā)育潛能和胚胎發(fā)育潛能的評價指標,這有助于提高水牛卵母細胞體

4、外成熟的效率和早期胚胎移植的效率,也可為人類輔助生育技術(shù)的發(fā)展開辟新的研究思路。
　　 具體研究內(nèi)容分為如下五個部分:
　　 研究一,小鼠睪丸新基因Slxl1的克隆、表達和功能鑒定,該基因所編碼的蛋白參與精子頂體的形成和精子受精的進程。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR檢測不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn),Slxl1mRNA在小鼠睪丸中特異性表達;(2)利用抗原設計、融合蛋白原核表達和抗體

5、純化制備技術(shù)獲得了針對SLXL1蛋白的特異性多克隆抗體;(3)在蛋白水平上,利用免疫印跡技術(shù)檢測不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn),Slxl1編碼一個18kDa的蛋白并特異性的表達于睪丸組織中;(4)通過制備的多克隆抗體進行免疫組化試驗發(fā)現(xiàn),該蛋白定位在圓形精子、延長型精子、附睪精子和成熟精子的頂體上;進一步研究還發(fā)現(xiàn),該蛋白的表達趨勢與精子頂體的形成趨勢一致,上述結(jié)果表明該蛋白參與了精子頂體的形成;(5)通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn),該蛋白與精子的頂

6、體蛋白DKKL1有相互作用并一起共定位在精子的項體上;(6)體外受精試驗發(fā)現(xiàn),應用制備的兔源多克隆抗體可封閉該蛋白并導致體外受精率嚴重下降,而對照組的受精率沒有顯著變化。上述結(jié)果表明Slxl1是一個睪丸特異性表達蛋白,也是一個精子頂體相關(guān)蛋白。該蛋白不但參與了精子項體的形成過程而且還參與了精子和卵子的受精過程。
　　 研究二,小鼠Slx2基因的克隆、表達和功能鑒定,該基因所編碼的蛋白參與了減數(shù)分裂過程中聯(lián)會復合體的形成、同源染色

7、體重組、DNA斷裂修復和性染色體的失活等過程。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR技術(shù)檢測不同組織和不同階段的睪丸和卵巢發(fā)現(xiàn),Slx2mRNA只在小鼠睪丸和卵巢中特異性表達;(2)利用抗原設計、原核表達和抗體制備技術(shù)獲得了針對SLX2蛋白的特異性多克隆抗體;(3)在蛋白水平上,利用免疫印跡技術(shù)檢測不同組織和不同階段的睪丸和卵巢發(fā)現(xiàn),Slx2編碼的蛋白特異性的表達于出生后的睪丸組織和出生前的卵巢組織中;(

8、4)通過制備的多克隆抗體進行免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)該蛋白與磷酸化組蛋白H2AX一起共定位在第一次減數(shù)分裂期的XY小體上。SLX2的表達趨勢與γH2AX的表達相似,而γH2AX是一個在減數(shù)分裂期特異性表達的蛋白,該蛋白與DNA損傷修復和性染色體的失活相關(guān),該結(jié)果表明SLX2參與了XY小體的形成、DNA損傷修復和性染色體的失活;(5)利用酵母雙雜交和免疫共沉淀試驗發(fā)現(xiàn),SLX2與減數(shù)分裂復合體重要組成蛋白SYCE2和乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT5/TIP60

9、有相互作用,同時γH2AX蛋白和KAT5/TIP60蛋白相互作用一起參與了同源染色體重組和DNA斷裂修復。上述結(jié)果表明SLX2蛋白與SYCE2蛋白參與了聯(lián)會復合體的形成、同源重組和染色體斷裂修復;上述結(jié)果還表明SLX2、SYCE2、KAT5/TIP60和γH2AX蛋白一起參與了減數(shù)分裂過程中的聯(lián)會復合體的形成、同源染色體重組、DNA斷裂修復和性染色體的失活等過程。
　　 研究三,一個小鼠新基因Xlr5c的克隆、表達和鑒定,該基因

10、所編碼的蛋白參與初級精母細胞第一次減數(shù)分裂的過程。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR檢測不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn)Xlr5cmRNA只在小鼠睪丸和卵巢中特異性表達;(2)利用蛋白抗原設計、原核表達和抗體制備技術(shù)獲得了針對XLR5C蛋白的多克隆抗體;(3)在蛋白水平上,利用免疫印跡技術(shù)檢測不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn),Xlr5c編碼的蛋白特異性的表達于睪丸和卵巢組織中;它的表達明顯發(fā)生在精子減數(shù)分裂的

11、時間段中,該結(jié)果表明Xlr5c是一個時間相關(guān)性的基因,主要出現(xiàn)在精子發(fā)生的早期;(4)通過制備的多克隆抗體進行免疫組化試驗發(fā)現(xiàn),該蛋白定位在睪丸的生精細胞中,主要出現(xiàn)在發(fā)生減數(shù)分裂的精母細胞細胞核中。該結(jié)果顯示該基因所編碼的蛋白參與了精母細胞減數(shù)分裂的進程;此外,在雌性卵泡的細胞質(zhì)中也檢測到它的表達。上述結(jié)果表明,該蛋白可能還參與精母細胞減數(shù)分裂的進程,可能在卵母細胞減數(shù)分裂中也有一定的功能。
　　 研究四,熒光原位雜交分析研究

12、X染色體在生殖細胞中的定位,該定位可以作為牛(水牛)分離精子純度鑒定和早期胚胎性別鑒定的一種客觀鑒定手段。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)利用顯微切割技術(shù)和PCR技術(shù)制備了具有檢測有效性的牛X染色體熒光原位雜交探針;該探針可以特異性的與牛中期染色體的X染色體雜交;(2)熒光原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)牛X染色體探針能檢測牛和水牛正常和分離精子的比率及早期胚胎卵裂球的性別。上述試驗結(jié)果表明牛X染色體熒光原位雜交探針可以作為一種十分有效的方法用于牛

13、和水牛分離精子比率的鑒定和早期胚胎性別的鑒定。
　　 研究五,分析和研究活性線粒體在水牛卵巢顆粒細胞、精子細胞、體外培養(yǎng)成熟前后的卵母細胞以及早期胚胎發(fā)育過程中的凋亡、分布和變化。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于中型(3～6mm)卵泡的卵巢顆粒細胞的凋亡率明顯低于來源于大型卵泡(＞6mm)和小型卵泡(＜3mm)的顆粒細胞的凋亡率;(2)精子的活性線粒體主要定位在精子的尾部中段,這表明水牛精子尾部的運動所消耗

14、的能量主要來源于其線粒體所產(chǎn)生的ATP;(3)在體外培養(yǎng)成熟前后的卵母細胞中檢測發(fā)現(xiàn),活性線粒體的分布變化趨勢主要是從卵子的周邊逐漸向卵子的中心和染色體部位聚集;(4)在體外受精的合子細胞中,活性線粒體主要聚集在兩個原核的周邊;(5)活性線粒體在體外培養(yǎng)的不同時期的植入前胚胎中發(fā)生明顯的位移變化?？傊?水牛卵巢顆粒細胞的凋亡率與卵泡的大小有關(guān);活性線粒體在水牛卵母細胞的體外成熟、受精和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)生顯著的位移變化,這表明線粒體可