電針“內關”穴改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚效應及其機制研究.pdf

1、眾所周知，高血壓是導致各種心血管疾病發(fā)生的最為關鍵的危害因素之一，長期高血壓可以引起心臟結構的異常及高血壓性心肌舒縮功能的損害。其中，最常見的病癥為高血壓性心肌肥厚，主要表現(xiàn)為心肌細胞代償性肥大，心臟間質成纖維細胞增殖以細胞外基質大量積聚，最終可導致心律失常、心肌梗死、心力衰竭和心源性猝死。相關研究揭示，高血壓-心肌肥大-心肌纖維化病理進程的發(fā)生除了與持續(xù)高血壓引起的心肌壓力和容量超負荷有關外，多種神經(jīng)體液因素也在該病的形成過程中扮演重

2、要角色，主要包括交感神經(jīng)長期過度興奮和β1-腎上腺受體(β1-AR)活性的異常增加，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活動的異常和相關細胞因子及生長因子的活化，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)及基質外金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs)等。近年來，逆轉左心室肥厚、心肌纖維化及左心室舒縮功能損害被認為是治療慢性高血壓的關鍵環(huán)節(jié)，并成為醫(yī)學界研究熱點。目前，盡管臨床上用于控制血壓、逆轉心肌肥大和心功能損害的許多新穎的藥物

3、不斷的涌現(xiàn)，但僅有少數(shù)高血壓患者的癥狀能夠得到較理想的控制，究其原因主要是這些藥物的低兼容性，且靶點較為單一，并伴有諸多毒副作用。相關研究證實，針刺某些穴位具有直接的降壓效應，其可通過軀體-自主神經(jīng)反射影響腦干交感中樞核團的傳出活動，或經(jīng)興奮迷走神經(jīng)的功能活動來對抗慢性高血壓狀態(tài)下交感神經(jīng)的過度緊張性活動及過度激活的β1-AR。除神經(jīng)機制外，針刺還可以通過調節(jié)上述參與高血壓病理進程的內分泌網(wǎng)絡，包括RAS、炎癥因子和酶類等，從而改善慢性

4、高血壓及誘發(fā)癥狀。此外，針刺內關穴可通過調節(jié)心肌細胞內Ca2+濃度及與鈣信號相關蛋白有效地改善心功能，適用于心律不齊、心絞痛、心功能不全等多種心血管疾病的治療。因此，進一步探索和揭示針刺對高血壓-心肌肥厚-心功能損害的作用效果具有一定的科學價值和潛在的臨床應用前景。
　　1.實驗目的
　　本研究以12周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為研究對象，以同周齡WistarKyoto(WKY)作為對照組，采用無創(chuàng)血壓記錄和超聲心動圖技

5、術，觀察連續(xù)8周電針“內關”穴對SHR模型大鼠血壓和心臟結構、功能動態(tài)變化的影響;在確定電針有效改善高血壓-心肌肥厚/纖維化-心功能損害病理進程的基礎上，通過免疫組織化學染色、Western Blotting、 Real-Time PCR和放射免疫等方法，揭示電針“內關”穴發(fā)揮該效應的分子生物學機制，旨在為高血壓-心肌肥厚/纖維化-心功能損害的臨床治療提供新的途徑。
　　2.實驗方法
　　本研究實驗分兩階段進行。
　　

6、第一部分，主要觀察電針內關穴抑制SHR左心室肥厚及舒縮功能損害的療效:實驗選用SPF級健康雄性12周齡WKY10只作為正常組，另選同周齡自SHR30只，分為SHR、SHR+EA、 SHR+Sham組，每組大鼠各10只。其中，SHR+EA組選取雙側“內關”穴干預（2/15Hz，1mA，持續(xù)30 min），每日1次，共8周。假電針組僅于內關穴淺刺，不給予電刺激。于電針前和每周電針后采用無創(chuàng)血壓儀測量各組大鼠清醒狀態(tài)下下尾動脈收縮壓(SBP)

7、、舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP);采用高分辨率超聲心動圖影像系統(tǒng)分別于電針干預前及電針干預第2，4，6，8周后進行超聲心動圖檢查，觀察各組大鼠心肌肥厚指標的差異。于電針干預結束后稱量左心室濕重，并計算心重體重比(HMI)，左心室心肌質量指數(shù)(LVMI)。采用HE染色法、VG染色法，免疫熒光組織化學染色技術和Western Blotting等分析法觀察心肌組織病理組織學改變及心肌組織中collagenⅠ、collagenⅢ表達量的

8、變化。
　　第二部分，主要是對電針內關穴延滯SHR心肌肥厚的機制探討:實驗選SPF級健康雄性12周齡SHR18只，分為三組，即SHR、SHR+EA、 SHR+Sham組，每組大鼠各6只。同周齡的WKY作為正常血壓對照組，給予電針干預，干預方法及參數(shù)同上。于電針干預結束后，采用放射免疫法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa法)和Real-Time PCR測定檢測大鼠心肌組織或血清中ACE含量及TNF-α的表達。采用免疫印跡法(Wester

9、n Blotting)觀察比較心肌組織AT1R、AT2R、β1-AR、TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達變化。采用Real-Time PCR法觀察TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量的變化。通過系統(tǒng)分析電針內關穴是否通過影響上述重要靶點從而達到改善高血壓心肌肥厚的效應，以探討哪些因素可能參與了電針內關穴改善高血壓-心肌肥厚的相關機制。
　　3.實驗結果
　　3.1.電針緩解S

10、HR左心室肥厚及心功能損害的療效觀察
　　3.1.1.電針內關穴對SHR血壓的影響
　　各組大鼠動態(tài)無創(chuàng)血壓記錄結果顯示，與自身的基礎值比較，從電針干預5周后，SHR+EA組DBP和MAP顯著降低(P＜0.05)。從電針干預6周后，SHR+EA組SBP顯著降低(P＜0.05);而SHR組大鼠SBP、DBP和MAP均顯著升高（P均＜0.05）。與WKY組比較，SHR組和SHR+Sham組的SBP、DBP和MAP均顯著升高（P均

11、＜0.05），并隨周齡增加持續(xù)上升。與SHR組比較，從電針內關干預5周后，SHR+EA組SBP、DBP和MAP均顯著降低(P均＜0.05)，但假電針組MAP、SBP、DBP未見顯著變化，始終與模型組數(shù)值接近，均保持在較高水平(P＞0.05)，提示電針內關穴能夠顯著降低SHR高血壓癥狀。
　　3.1.2.電針內關穴對SHR大鼠心重體重比和左心室重量指數(shù)的影響
　　與WKY組相比，SHR組的心重/體重比(HW/BW)，左室重量指

12、數(shù)(LVWI)顯著升高(P＜0.001)，提示SHR出現(xiàn)心肌肥厚的表現(xiàn)。電針內關穴可以顯著地抑制SHR組HW/BW和LVWI的升高幅度(P＜0.001，P＜0.01)，這表明電針內關穴可有效改善SHR心肌肥厚癥狀。
　　3.1.3.電針內關穴對SHR心肌組織形態(tài)學改變的影響
　　光鏡下觀察HE染色心肌切片可見:與WKY組比較，SHR組左心室腔明顯縮小，心肌明顯增厚， SHR+EA組可明顯改善SHR組左心室腔縮小和心肌增厚的現(xiàn)

13、象。而與SHR組比較，SHR+Sham組，沒有明顯變化。與WKY組比較，SHR組心肌細胞腫脹并且伴有炎性細胞浸潤。電針干預八周后，心肌細胞體積不同程度減小，炎性細胞浸潤現(xiàn)象減輕。與WKY組比較，SHR組的心肌細胞直徑和橫截面積顯著增大(P＜0.05，P＜0.001)，與SHR組比較，SHR+EA組的心肌細胞直徑和橫截面積均減?。≒＜0.05，P＜0.001），而SHR+Sham組沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。以上結果表明電針內關穴可有

14、效改善高血壓心肌肥厚狀態(tài)下心臟結構和局部組織形態(tài)學的病理改變。
　　3.1.4.電針內關穴對SHR心功能各項指標的影響
　　WKY組隨周齡的增加，其LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVEF、 LVFS指標沒有顯著變化。與WKY組相比，SHR組LVAWd、LVPWd顯著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，而LVEF、LVFS、LVIDd顯著降低，提示SHR出現(xiàn)心肌肥厚表現(xiàn)。與SHR組比較，電針內關穴6周后，

15、SHR+EA組LVAWd顯著降低(P＜0.01)，LVEF、LVFS、LVIDd顯著升高(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001);電針8周后， LVPWd亦顯著降低（P＜0.05），SHR+Sham組上述各指標表現(xiàn)與SHR組一致，兩組之間無統(tǒng)計學差異。以上結果提示電針內關穴可有效緩解SHR心肌肥厚癥狀。
　　WKY隨周齡的增加E/A比值沒有變化。與WKY組相比，SHR組的E/A比值顯著降低(P＜0.001)，提示SHR出現(xiàn)

16、了心肌舒縮功能的損害。與SHR組比較，電針內關穴6周，SHR+EA組E/A比值顯著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001);SHR+Sham組E/A變化與SHR組一致，且兩組間無統(tǒng)計學差異。這表明電針內關穴可有效改善SHR心肌舒縮功能。
　　3.1.5.電針內關穴對SHR心肌組織膠原分布及羥脯胺酸含量的影響
　　與WKY組比較，SHR組心肌纖維變粗，腫脹、間隙不清、斷裂、融合或排列紊亂，心肌細胞明顯肥大、濁腫，空泡

17、樣變化;細胞紅色染色較多，提示膠原纖維增生明顯。與SHR組比較，SHR+EA組上述心肌組織的病理損傷明顯減輕，紅色范圍逐漸減少，提示心肌纖維化程度逐漸減輕;而SHR+Sham組病理損傷減輕不明顯。與WKY組相比，SHR組心肌間質膠原面積(CA)，心肌肌原容積分數(shù)(CVF)、羥脯胺酸(Hyp)的含量顯著增高(P＜0.01，P＜0.001)。電針內關穴可以顯著地抑制SHR組CA、CVF和Hyp的升高幅度(P＜0.05，P＜0.01)，提示電

18、針內關穴可有效抑制SHR心肌纖維化表現(xiàn)。與SHR組比較，SHR+Sham組上述三個指標無顯著變化。以上結果表明電針內關穴可有效改善SHR心肌纖維化。
　　3.1.6.電針內關穴對SHR心肌組織Ⅰ型ColⅠ、ColⅢ表達的影響
　　依據(jù)免疫染色結果，與WKY組相比，SHR細心肌間質ColⅠ、ColⅢ熒光共表達顯著增加，說明心肌間質膠原沉積現(xiàn)象明顯。與SHR組比較，SHR+EA組心肌間質ColⅠ、ColⅢ熒光共表達明顯減少，SH

19、R+Sham組ColⅠ表達亦有一定程度的降低、而ColⅢ熒光共表達變化不明顯。定量分析結果統(tǒng)計顯示:與WKY組相比，SHR組心肌組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達顯著升高(P＜0.001);與SHR組比較，SHR+EA組心肌組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達顯著下降(P＜0.001)，此外，SHR+Sham組心肌組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達也出現(xiàn)一定程度的降低，但沒有統(tǒng)計學差異。以上結果表明，電針內關穴可通過下調ColⅠ、ColⅢ蛋白表達從而

20、緩解SHR心肌纖維化。
　　3.2.電針抑制高血壓-心肌肥厚機制探討
　　3.2.1.電針內關穴對SHR心肌組織β1-AR蛋白表達的影響
　　與WKY組相比，SHR組心肌組織β1-AR蛋白表達顯著升高(P＜0.01)。與SHR組比較，SHR+EA組心肌細胞β1-AR蛋白表達顯著下降（P＜0.001），提示電針內關穴可能通過降低心肌細胞β1-AR表達，從而改善SHR心肌肥厚發(fā)展進程。這表明β1-AR可能是介導電針抑制高血

21、壓心肌肥厚的機制之一。
　　3.2.2.電針內關穴對SHR體內ACE含量及心肌組織AT1R、AT2R蛋白表達的影響
　　與WKY組相比，SHR組血清和心肌組織中ACE的含量顯著升高(P＜0.001)。電針干預可明顯抑制SHR血清和心肌組織中ACE含量的異常升高(P＜0.001);SHR+Sham組上述ACE含量與SHR組無顯著差異。與WKY組相比，SHR組心肌細胞AT1R蛋白表達顯著升高(P＜0.001)，而AT2R蛋白表達

22、顯著降低(P＜0.001)。與SHR組比較，SHR+EA組心肌細胞AT1R蛋白表達顯著下降(P＜0.001)，AT2R蛋白表達顯著升高(P＜0.01)，提示AT1R、AT2R蛋白可能是電針內關穴改善SHR心肌肥厚發(fā)展進程的分子途徑之一。該部分結果提示對血管緊張素系統(tǒng)(ACE、AT1R、AT2R)的調節(jié)作用可能介導了電針抑制高血壓心肌肥厚的作用。
　　3.2.3.電針內關穴對SHR血清TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達

23、的影響
　　與WKY組相比，SHR血清中TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達顯著升高(P＜0.001)。與SHR組比較，SHR+EA組血清中TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達顯著下降（P＜0.001）。這表明TNF-α與高血壓心肌肥厚密切相關，調節(jié)血清和心肌組織中TNF-α含量及表達可能是介導電針抑制高血壓心肌肥厚的機制之一。
　　3.2.4.電針內關穴對SHR心肌組織TGF-β1、CTGF表達的影

24、響
　　與WKY組相比，SHR組心肌間質TGF-β1和CTGF的熒光強度，蛋白及mRNA相列表達量顯著升高(P＜0.001)。與SHR組比較， SHR+EA組心肌組織TGF-β1和CTGF的熒光強度，蛋白及mRNA相對表達量顯著下降(P＜0.01，P＜0.001)。提示電針內關穴對SHR組TGF-β1和CTGF異常表達的下調作用可能介導了電針緩解高血壓心肌肥厚的作用。
　　3.2.5.電針內關穴對SHR心肌組織MMP-2、M

25、MP-9 mRNA及其蛋白表達的影響
　　各組間MMP-2 mRNA及其蛋白表達無顯著差異。提示由于各組之間的MMP-2 mRNA及其蛋白表達沒有明顯的區(qū)別，因此，不能肯定MMP-2參與了介導電針抑制高血壓心肌肥厚的作用。與WKY組相比，SHR組心肌組織MMP-9mRNA及其蛋白表達明顯降低（P＜0.001）。與SHR組比較，SHR+EA組心肌組織MMP-9蛋白表達及mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05），但SHR+Sham組

26、MMP-9蛋白表達及mRNA相對表達量未見顯著變化。提示MMP-9可能介導了電針抑制心肌纖維化的進程。
　　4.結論
　　SHR除表現(xiàn)為血壓升高外，其左心室壁厚度、HW/BW、LVWI顯著增加，射血功能明顯減弱，CVF及Hyp、collagenⅠ、collagenⅢ的表達異常增高，說明出現(xiàn)心肌肥厚為主要特征的心肌重塑，并伴有心功能受損。電針內關穴可以顯著地抑制SHR血壓的升高，改善心室厚度、LVEF等心功能指標，抑制HW/B

27、W、LVWI等的異常增加，此外，電針內關穴一定程度上改善了SHR心肌組織形態(tài)，減少了SHR心肌細胞直徑和橫截面積和CVF的過度增加，抑制了SHR心肌組織Hyp、collagenⅠ和collagenⅢ的異常表達，提示電針改善SHR高血壓心肌肥厚發(fā)展進程療效明確。
　　電針內關穴在改善高血壓-心肌肥厚的同時，可以明顯抑制SHR血清或心肌組織中ACE、β1-AR、AT1R、TNF-α、TGF-β1、CTGF、MMP-9的異常表達，提示血