MBP-LMO2-L-S的表達(dá)純化及轉(zhuǎn)錄因子GATA-1-2-3和LMO2-L-S之間相互作用的研究.pdf

1、LMO2隸屬于LMO家族，其基因定位于人類11號染色體短臂1區(qū)3帶(11p13)，最早是從帶有染色體易位t(11；14)(p13；q11)的急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)患者病變細(xì)胞的染色體斷裂點(diǎn)處克隆得到的。LMO2基因?qū)t系細(xì)胞和T淋巴系細(xì)胞的分化和發(fā)育都具有重要的作用。
　　 具體來說，LMO2屬于具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具備特征性的LIM結(jié)構(gòu)域，它的功能主要是通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。已有的研究已經(jīng)表

2、明，LMO2本身缺乏直接結(jié)合DNA的能力，通常作為橋梁分子通過LDB1將GATA-1、TAL1、E47等轉(zhuǎn)錄因子聚集形成一復(fù)合物，并結(jié)合于DNA上毗鄰的GATA和E-box位點(diǎn)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，抑或在病理?xiàng)l件下結(jié)合于只包含兩個E-box的位點(diǎn)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室近年來一直致力于LMO2可能參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控路徑的研究，之前的研究工作中還發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了LMO2基因具有兩種蛋白產(chǎn)物：LMO2-L和LMO2-S，LMO2-S

3、與LMO2-L一樣，具備征性LIM結(jié)構(gòu)域，但是兩者在N端有14個氨基酸的不同，且在數(shù)目上LMO2-S比LMO2-L少了7個氨基酸，但是我們發(fā)現(xiàn)LMO2-S可以同LMO2-L一樣結(jié)合LMO2復(fù)合體中的其它轉(zhuǎn)錄因子，但就與LDB1的結(jié)合能力而言，LMO2-S與它的結(jié)合力遠(yuǎn)低于LMO2-L。而對于不同的靶基因，LMO2-L與LMO2-也表現(xiàn)出不同的作用方式。在蛋白相互作用水平上，LMO2-L與LMO2-S對某些蛋白的功能影響也各不相同。本文便

4、嘗試探索LMO2-L、LMO2-S與GATA-1/2/3的結(jié)合能力的差異及與此相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，并試圖通過MBPpulldown篩選出未知的可能與LMo2-L/S存在相互作用的轉(zhuǎn)錄因子?，F(xiàn)將已完成的工作報(bào)告如下：
　　 1.融合蛋白MBP-LMO2-L/S的表達(dá)純化構(gòu)建表達(dá)融合蛋白MBP-LMO2-L/S的原核表達(dá)載體，經(jīng)過IPTG的誘導(dǎo)，能夠大量表達(dá)MBP-LMO2-L/S，使用amylose resin作為固相支持物，通過親和

5、層析、透析處理等方法，純化MBP-LMO2-L/S，得到蛋白的濃縮液，并進(jìn)一步通過考馬斯亮藍(lán)染色的方法鑒定融合蛋白的純化效果。
　　 2.轉(zhuǎn)錄因子GATA-1/2/3和LMO2-L/S之間相互作用的研究基于我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究成果，認(rèn)為GATA-1/2/3可能作為轉(zhuǎn)錄因子，參與到LMO2相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控路徑。我們利用之前純化的的融合蛋白，進(jìn)行MBP pulldown實(shí)驗(yàn)，通過體外實(shí)驗(yàn)研究蛋白之間的相互作用。同時構(gòu)建一系列真核表