大鼠GAPDH、β-actin mRNA降解與死亡時間推斷的相關(guān)性研究.pdf

1、背景：死亡時間(postmorteminterval，PMI)或稱死后經(jīng)過時間(timesincedeath，TSD)即發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔，PMI推斷是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最為重要的研究課題之一。但由于影響PMI推斷的因素很多，單一方法的準(zhǔn)確性往往不能令人滿意，多因素、多指標(biāo)的綜合研究，即人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificialneuralnetwork，ANN)的研究成為趨勢。隨著分子生物學(xué)和計算機技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，通過檢測mRN

2、A降解推斷PMI成為可能。本研究應(yīng)用一步法熒光標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)檢測了大鼠死后不同時間間隔腦、肝、脾、腎管家基因磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH)及β-肌動蛋白(β-actin)mRNA的降解情況，旨在為PMI推斷提供一種新的指標(biāo)。 目的：通過系

3、統(tǒng)觀察大鼠死后不同時間腦、肝、脾、腎管家基因GAPDH及β-actinmRNA的降解規(guī)律，確定大鼠死后不同組織GAPDH及β-actinmRNA的檢測時限，探討其在PMI推斷上的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值，為PMI推斷的研究提供一種新的、可靠的檢測指標(biāo)。 方法：Wistar大鼠56只，雌雄不限，體重200～250g，斷頸處死后置于20℃溫度控制系統(tǒng)內(nèi)。分別于死后0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、72h、4d、5d、6d、7

4、d、8d、9d解剖(n=4)，按照RNA抽提的方法，分別提取大鼠腦、肝、脾、腎的總RNA，利用ABI9700型PCR基因擴增儀，通過一步法復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)擴增，各時間點擴增產(chǎn)物分別在ABI3100型DNA遺傳分析儀上進(jìn)行電泳分離，并應(yīng)用其自帶的分析軟件(GeneScanAnalysisVersion3.1)，通過與Genescan-500TMROX(marker)標(biāo)準(zhǔn)分子量作比對，確定腦、肝、脾、腎管家基因GAPDH及β-act

5、inmRNA轉(zhuǎn)化的PCR產(chǎn)物，記錄并分析每個特異性峰的峰面積(PeakArea)，各時間點與死后即時(0h)的峰面積之比值作為該點mRNA的相對含量。以未加RT/Platinum(R)Taq混合酶的作為實驗陰性對照組。 結(jié)果：大鼠死后7d腦組織、48h肝組織、32h脾組織、40h腎組織內(nèi)均可檢測到GAPDHmRNA，8d腦組織、72h肝組織、40h脾組織、48h腎組織內(nèi)均可檢測到β-actinmRNA，且其量均呈規(guī)律性下降趨勢(

6、電泳峰面積逐漸變小、譜帶亮度逐漸變暗并最終消失)，其擴增產(chǎn)物的降解過程呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。應(yīng)用EXCEL2003及SPSS11.5對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理及線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)大鼠死后不同時間腦、肝、脾、腎GAPDH及β-actinmRNA的相對含量均與PMI高度相關(guān)(P＜0.01)，并得出相應(yīng)的回歸方程： 1.大鼠PMI(x，d)與腦mRNA含量(y)的回歸方程：GAPDH：y=-0.122x+0.923，R2=0.973(x≤

7、7d)β-actin：y=-0.104x+0.925，R2=0.973(x≤8d) 2.大鼠PMI(x，h)與肝mRNA含量(y)的回歸方程：GAPDH：y=-0.019x+0.989，R2=0.968(x≤48h)β-actin：y=-0.013x+0.945，R2=0.890(x≤72h) 3.大鼠PMI(x，h)與脾mRNA含量(y)的回歸方程：GAPDH：y=-0.025x+1.054，R2=0.969(x≤32

8、h)β-actin：y=-0.023x+1.021，R2=0.993(x≤40h) 4.大鼠PMI(x，h)與腎mRNA含量(y)的回歸方程：GAPDH：y=-0.022x+1.049，R2=0.978(x≤40h)β-actin：y=-0.018x+0.975，R2=0.991(x≤48h) 結(jié)論：本實驗可得出以下結(jié)論： 1.大鼠死后管家基因GAPDH、β-actinmRNA具有一定的穩(wěn)定性。 2.大鼠

9、死后不同組織、不同管家基因mRNA的穩(wěn)定性(即檢測時限)不同：對于GAPDH，腦為7d，肝為48h，脾為32h，腎為40h；對于β-actin，腦為8d，肝為72h，脾為40h，腎為48h；與GAPDHmRNA相比，β-actinmRNA更不易降解。 3.一步法熒光標(biāo)記RT-PCR技術(shù)檢測大鼠死后不同組織(腦、肝、脾、腎)管家基因GAPDH及β-actinmRNA的降解規(guī)律，可為PMI推斷的研究提供一種新的、客觀、有效的觀測指標(biāo)