知母百合藥對(duì)的化學(xué)成分分析及藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、知母(RHIZOMA ANEMARRHENAE)和百合(BULBUS LILII)均為百合科植物，是我國民間常用的傳統(tǒng)中草藥，具有清熱除煩、瀉肺滋腎、養(yǎng)陰潤肺以及清心安神的功效。知母百合藥對(duì)由知母和百合兩味中藥組成，記載于東漢張仲景的《金匱要略》中,具有滋陰養(yǎng)肺，去火等臨床療效。本論文基于現(xiàn)代聯(lián)用分析技術(shù)，以知母和百合兩味中藥為研究對(duì)象，從體內(nèi)外成分分析入手，建立了一套用于中藥體內(nèi)外成分鑒別與藥效成分初步篩選的方法與模式，并將這些方法及

2、相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于中藥全面質(zhì)量控制與體內(nèi)多成分藥代動(dòng)力學(xué)研究中。以知母百合藥對(duì)中皂苷類成分、雙苯吡酮類成分、蒽醌類成分和生物堿類成分為分析對(duì)象，運(yùn)用HPLC-TOF/MS聯(lián)用分析技術(shù)對(duì)中藥體內(nèi)外所含主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒別，對(duì)主要化學(xué)成分的質(zhì)譜碎裂規(guī)律進(jìn)行了初步解析。
　　 一、知母藥材化學(xué)成分分析的研究
　　 第一，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)知母藥材的化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別與結(jié)構(gòu)解析。得到的化合物精確分子量與建立的知母化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)

3、庫做比對(duì)，鑒定出的21個(gè)化合物包括：18個(gè)皂苷類成分、3個(gè)雙苯吡酮類成分。分析確認(rèn)了已知活性成分的結(jié)構(gòu)，并獲取了它們的裂解規(guī)律。同時(shí)對(duì)其中一些未知成分進(jìn)行了分析，通過與文獻(xiàn)的對(duì)照，推測(cè)了其中一些未知成分的結(jié)構(gòu)。知母皂苷類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別在于其結(jié)構(gòu)母核上的連接基團(tuán)的種類和數(shù)目不同，大多數(shù)知母皂苷類成分其結(jié)構(gòu)母核上的連接基團(tuán)為-O-nG，-CH3,-OH,-OCH3等，這使得皂苷類成分在碎裂電壓下裂解時(shí)，容易形成[M+H-n*162]

4、+, [M+H-15]+, [M+H-18]+,[M+H-31]+的碎片離子。如果在知母皂苷類成分結(jié)構(gòu)母核的C-5和C-6 位置有一個(gè)雙鍵，C-3 位上連接有-OH基團(tuán)，由于連接-OH的相鄰C 均為飽和烴形式，因此其很容易失去一分子水形成雙鍵。對(duì)于脫水后的雙鍵位置，從知母皂苷結(jié)構(gòu)母核的共軛系統(tǒng)考慮，為保持結(jié)構(gòu)母核的穩(wěn)定性，只可能在C-3和C-4 形成雙鍵。在知母皂苷類成分的裂解碎片中，出現(xiàn)的[M+H-15]+, [M+H-31]+，多是

5、由于從知母皂苷結(jié)構(gòu)母核上失去-CH3,-OCH3中性碎片所得，根據(jù)結(jié)構(gòu)母核的立體結(jié)構(gòu)推斷，失去的-CH3，-OCH3 多是連接在C-15和C-22 位上。對(duì)于C-23 位有-OH的知母皂苷類成分，如知母皂苷F，在裂解時(shí)首先發(fā)生麥?zhǔn)现嘏牛绻贑-15 位含有-OH，進(jìn)行麥?zhǔn)现嘏藕螅瑫?huì)再脫去一分子水；C-22、C-23 鍵極不穩(wěn)定易進(jìn)行α裂解。其它裂解方式跟知母皂苷類化學(xué)成分的裂解方式類似。
　　 第二，采用HPLC-DAD-MS

6、對(duì)知母藥材中兩種雙苯吡酮類成分和五種皂苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定。在系統(tǒng)考察了色譜質(zhì)譜條件和樣品前處理方法的基礎(chǔ)上，建立了采用HPLC-DAD-MS 法同時(shí)測(cè)定知母中七個(gè)成分的含量測(cè)定方法；并對(duì)該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明該含量測(cè)定方法可用于知母中七個(gè)成分的含量測(cè)定。將該方法應(yīng)用于10個(gè)不同產(chǎn)地和批次的知母藥材中七個(gè)成分的含量測(cè)定。首次實(shí)現(xiàn)HPLC-DAD-MS 聯(lián)用一個(gè)系統(tǒng)對(duì)知母藥材中兩類具有不同檢測(cè)性質(zhì)共七個(gè)成分的含量

7、測(cè)定。本文所建立的分析方法專屬、準(zhǔn)確、靈敏、高效，為知母藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的方法。
　　 第三，應(yīng)用單四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)對(duì)知母藥材中的七種有效成分做藥動(dòng)學(xué)研究。采用液-液萃取法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理，色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18(2.1×50mm,1.8μm)；流動(dòng)相為0.1％ 甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫；采用正離子檢測(cè)方式，SIM 掃描模式。利用該法研究了SD大鼠灌胃給予知母提取液后七個(gè)主要成分的藥物動(dòng)力學(xué)

8、行為。結(jié)果顯示，知母提取液中知母皂苷E1和E的T1/2、Cmax和Tmax等參數(shù)均小于知母提取液中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷AIII。說明知母皂苷E1和E的吸收和代謝速度要快于知母提取液中的其他成分。灌胃給藥提取液后，知母中知母皂苷類成分的藥-時(shí)曲線成雙峰，這可能與腸肝循環(huán)有關(guān)。知母皂苷AIII的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)中Tmax明顯大于其它成分，顯示吸收和代謝慢于其它六個(gè)成分。知母提取液灌胃給藥后藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果提示

9、，中藥提取物混合給藥的藥效作用時(shí)間延長，顯示中藥中化學(xué)成分協(xié)同配伍作用的內(nèi)涵。
　　 二、百合藥材及知母百合藥對(duì)化學(xué)成分分析的研究
　　 第一，通過采用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)百合藥材的成分進(jìn)行定性鑒別與結(jié)構(gòu)解析。
　　 得到的化合物精確分子量與建立的百合化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫做比對(duì)，鑒定得到五個(gè)化合物：2個(gè)皂苷類、1個(gè)蒽醌類和2個(gè)生物堿類成分。分析確認(rèn)了五個(gè)成分的結(jié)構(gòu)，并獲取了它們的裂解規(guī)律。百合皂苷類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別在于

10、其結(jié)構(gòu)母核的不同，百合皂苷1其結(jié)構(gòu)母核為替告皂苷元，而百合皂苷2的結(jié)構(gòu)母核為薯蕷皂苷元。這使得百合皂苷類成分在進(jìn)行高電壓裂解時(shí)，形成了不同的碎片離子。如果在百合皂苷類成分結(jié)構(gòu)母核的C-5和C-6 位置有一個(gè)雙鍵，C-3 位上連接有-OH基團(tuán)，由于連接-OH的相鄰C 均為飽和烴形式，因此其很容易失去一分子水形成雙鍵。對(duì)于脫水后的雙鍵位置，從百合結(jié)構(gòu)母核的共軛系統(tǒng)考慮，為保持結(jié)構(gòu)母核的穩(wěn)定性，只可能在C-3和C-4 形成雙鍵。在生物堿類成分

11、的裂解碎片中，出現(xiàn)的[M+H-28]+，[M+H-28-59]+，多是由于從結(jié)構(gòu)母核上失去-CO和側(cè)鏈中性碎片所得，根據(jù)結(jié)構(gòu)母核的立體結(jié)構(gòu)推斷，失去的-CO和側(cè)鏈多是為了形成一個(gè)更徹底芳香化的結(jié)構(gòu)。
　　 第二，通過采用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)知母百合藥對(duì)的所有成分進(jìn)行定性鑒別與結(jié)構(gòu)解析。鑒定出的30個(gè)化合物包括：24個(gè)皂苷類成分、3個(gè)雙苯吡酮類成分、1個(gè)蒽醌類成分和2個(gè)生物堿類成分。闡述加入百合后對(duì)知母的物質(zhì)基礎(chǔ)的影響，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)新的知

12、母皂苷類成分：知母皂苷I、知母皂苷AI、知母皂苷G和知母皂苷D，并通過大量的特征碎片離子分析了其結(jié)構(gòu)、獲取了裂解規(guī)律。發(fā)展建立了一個(gè)用于復(fù)雜中藥體系中的藥對(duì)及復(fù)方進(jìn)行快速準(zhǔn)確分析的研究方法與模式。
　　 大多數(shù)知母皂苷類成分其結(jié)構(gòu)母核上C-15和C-22位上的連接基團(tuán)為-O-nG，-CH3,-OH,-OCH3等，因而在進(jìn)行高電壓裂解時(shí)，易形成[M+H-n*162]+, [M+H-15]+,[M+H-18]+, [M+H-31]+

13、的碎片離子。對(duì)于C-23位有-OH的知母皂苷類成分，在裂解時(shí)首先發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?。其它裂解方式跟知母皂苷類化學(xué)成分的裂解方式類似。
　　 在百合皂苷類成分結(jié)構(gòu)母核的C-5和C-6位置有一個(gè)雙鍵，C-3位上連接有-OH基團(tuán)，由于連接-OH的相鄰C均為飽和烴形式，因此其很容易失去一分子水形成共軛雙鍵。蒽醌類成分的裂解是典型的C16、C20并合吡啶5-孕甾烯類化合物的裂解模式，主要是通過失去側(cè)鏈糖基和-CH3后產(chǎn)生特征碎片離子。
　

14、　 第三，應(yīng)用單四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)對(duì)知母百合藥對(duì)中的七種成分做比較藥物動(dòng)力學(xué)研究。合用百合后，根據(jù)知母皂苷類成分和雙苯吡酮類成分在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行組間t 檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五個(gè)知母皂苷類成分在大鼠體內(nèi)的這些藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差別具有顯著意義。知母百合藥對(duì)提取液的T1/2、Tmax、Cmax和AUC等參數(shù)均小于知母提取液，但CL/F值大于后者。這表明知母百合藥對(duì)中七個(gè)成分的吸收和代謝速度要快于知母提取液中的七個(gè)成分，兩者合用能夠提高皂

15、苷類成分和雙苯吡酮類成分的吸收。灌胃給藥提取液后，知母中知母皂苷類成分的藥-時(shí)曲線成雙峰，這可能與腸肝循環(huán)有關(guān)。關(guān)于知母和百合的藥動(dòng)學(xué)研究很多，但是到目前為止沒有關(guān)于兩者配伍后對(duì)主要藥效成分體內(nèi)吸收影響的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 本文研究結(jié)果表明，知母和百合的配伍改變了七個(gè)有效成分的某些藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，這種現(xiàn)象可能是由于百合的加入促進(jìn)了皂苷類成分的吸收，從而影響了知母中有效成分的藥動(dòng)學(xué)行為，知母百合藥對(duì)的配伍增效作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。