赤芍與白芍的藥動學(xué)研究與化學(xué)成分的液質(zhì)聯(lián)用分析.pdf

1、赤芍與白芍為我國常用中藥材。赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonialactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch直接使用的干燥根;白芍為毛莨科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.水煮去皮后曬干使用的根。二者來源相近,但臨床功效卻不盡相同。赤芍具有清熱涼血,散瘀止痛的功效,用于溫毒發(fā)斑,吐血衄血,目赤腫痛,肝郁脅痛,經(jīng)閉痛經(jīng),癥瘕腹痛,跌撲損傷,癰腫瘡瘍。而自芍具有平肝止痛,養(yǎng)血調(diào)經(jīng),

2、斂陰止汗的功能,主要用于頭痛眩暈,脅痛,腹痛,四肢攣痛,血虛萎黃,月經(jīng)不調(diào),自汗和盜汗。
　　 本研究即從化學(xué)成分與藥動學(xué)兩方面著手,探討兩藥材基源相近卻功效迥異的原因。在提取分離制備白芍和赤芍有效成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的基礎(chǔ)上,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究大鼠灌胃赤芍或白芍提取物后芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的藥物動力學(xué)特征,并初步探討兩藥材的藥動學(xué)特征的差異。對赤芍、白芍、川赤芍與常用混淆品新疆芍藥的化學(xué)成

3、分進行HPLC-MS定性分析,并比較化學(xué)成分的差異。本研究對闡明赤芍、白芍的作用機制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)做出了有價值的探索,對指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。
　　 第一部分川赤芍化學(xué)成分研究(芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的制備)
　　 目的:從川赤芍中分離制備芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷3種成分。
　　 方法:采用硅膠柱色譜與ODS柱色譜的方法對川赤芍醇提物進行系統(tǒng)分離純化,通過薄層、UV和HPLC等方法對其分離產(chǎn)

4、物進行鑒定。
　　 結(jié)果:提取分離得到3個化合物,分別鑒定為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷。所得芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷用歸一化法定量,純度均大于98％。
　　 結(jié)論:本法簡便,制備成本低,芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷可作為定性定量分析使用的對照品,也可用于藥物代謝動力學(xué)的研究。
　　 第二部分赤芍與白芍提取物的藥動學(xué)研究
　　 目的:建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法同時測定大

5、鼠血漿中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的濃度,并將其用于SD大鼠灌胃赤芍或白芍提取物后血漿中3種成分的藥動學(xué)研究,初步比較赤芍和白芍兩種藥材藥動學(xué)特征的差異。
　　 方法:以0.2g·g-1相同生藥量灌胃給與大鼠赤芍或白芍提取物,分別于給藥后5,10,15,20,30,60,90,120,180,240,360和540min眼內(nèi)眥靜脈叢取血,制備血漿樣品后,采用甲醇沉淀蛋白的方法進行預(yù)處理,采用HPLC-MS法,以梔子苷為內(nèi)標(biāo)進

6、行分析:(1)色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax-C18柱(150mm×4.6mm,5μm),流動相為甲醇-0.1％甲酸水(33∶67),流速為0.7mL·min-1。(2)質(zhì)譜條件:ESI源,源電壓-4500V,負離子檢測,源溫度650℃,霧化氣(gas1)60 psi,加熱氣(gas2)65 psi,簾氣25 psi。檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,用于定量分析檢測的離子及各自的解簇電壓(DP)和裂解電壓(CE)分別

7、為m/z525.2→121.0(芍藥苷),DP-22V,CE-37eV;m/z525.2→121.0(芍藥內(nèi)酯苷),DP-30V,CE-37eV;m/z495.2→137.0(氧化芍藥苷),DP-65V,CE-40eV和m/z433.2→225.1(內(nèi)標(biāo)梔子苷),DP-20V,CE-19eV。
　　 結(jié)果:芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的線性范圍分別為0.9262～185.2,1.858～178.6和0.7689～38.22ng

8、·mL-1,最低定量限分別為0.9262,1.858和0.7689 ng。日內(nèi)和日間精密度(RSD)在0.5％和6.3％之間。其提取回收率在85.6％和105.2％之間。大鼠灌胃赤芍提取物后,3個主要成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的藥物動力學(xué)參數(shù)如下:T1/2分別為1.86±0.27,1.17±0.33和1.59±0.53 h,Tmax分別為0.67±0.07,0.33±0.15和0.33±0.06 h,ke分別為0.35±0.10

9、,0.59±0.09和0.44±0.06 h,Cmax分別為185.24±26.24,122.08±30.41和16.64±4.53 ng·ml-1,AUC0-t分別為48572.38±480.18,7796.00±125.33和69.73±5.52 ng·h·ml-1,AUC0-∞分別為52274.73±489.32,8804.31±100.92和83.92±2.99 ng·h·ml-1。大鼠灌胃白芍提取物后,芍藥內(nèi)酯苷出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象

10、,Tmax1和Tmax2分別為0.33±0.05和0.67±0.07 h,Cmax1和Cmax2分別為178.60±35.39和180.86±29.77 ng·ml-1,芍藥苷和氧化芍藥苷的Tmax分別為0.33±0.02和0.67±0.23 h,Cmax分別為34.44±13.42和19.22±3.81 ng·ml-1,3個主要成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的其他藥物動力學(xué)參數(shù)如下:T1/2分別為0.85±0.11,1.06±0.

11、13和2.21±0.78 h,ke分別為0.79±0.29,0.59±0.09和0.44±0.06 h,AUC0-t分別為288.66±80.38,14865.04±239.59和79.03±9.31 ng·h·ml-1,AUC0-∞分別為315.08±85.44,15646.40±228.44和99.27±8.76 ng·h·ml-1。白芍和赤芍中3個成分的AUC0-t、AUC0-∞之和分別為56438.11、61162.96 ng·

12、h·ml-1和15232.73、16060.76 ng·h·ml-1。
　　 結(jié)論:本文建立了同時測定血漿中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的HPLC-MS法,并將其應(yīng)用于SD大鼠灌胃赤芍或白芍提取物后3種成分的藥動學(xué)研究,并將得到的藥動學(xué)參數(shù)進行綜合,初步研究了赤芍和白芍兩種藥材藥動學(xué)性質(zhì)的差異。
　　 第三部分赤芍與白芍化學(xué)成分的HPLC-MS分析
　　 目的:建立HPLC-MS法定性分析赤芍、白芍、川赤芍和新

13、疆芍藥的化學(xué)成分,考察4種藥材的化學(xué)成分差異。
　　 方法:對芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷對照品進行一級質(zhì)譜(Q1)、子離子(Production)、母離子(Precusor ion)等多種掃描模式,分析其電噴霧電離質(zhì)譜裂解途徑,并總結(jié)單萜苷類成分的質(zhì)譜裂解特征。采用超聲提取法制備4種藥材的50％乙醇提取液,高速離心取上清液進行HPLC-MS分析:(1)色譜條件:Agilent Zorbax C18柱(250mm

14、×4.6mm,5μm),流動相為甲醇-0.1％甲酸水,梯度洗脫(0～8min,0～8％甲醇;8～10min,8～20％甲醇;10～30min,20～30％甲醇;30～40min,30～40％甲醇;40～65min,40～60％甲醇;65～75min,60～90％甲醇;75～80min,90％甲醇),流速為1mL·min-1。(2)質(zhì)譜條件:ESI源;源電壓-4500 V;負離子檢測;源溫度(TEM):650℃;霧化氣(gas1):65

15、psi,加熱氣(gas2):65 psi,簾氣(CUR):25 psi。檢測方式為多離子監(jiān)測-自動信息關(guān)聯(lián)-增強型子離子(MRM-IDA-EPI)模式,掃描質(zhì)量范圍m/z50～1000。
　　 結(jié)果:在負離子模式下,芍藥單萜苷類結(jié)構(gòu)中蒎烷基本骨架產(chǎn)生的m/z165碎片離子較常見,這一離子可作為芍藥苷類化合物的特征性碎片離子。同時葡萄糖或蒎烷骨架結(jié)構(gòu)連有不同的取代基時,相應(yīng)的碎片離子也會出現(xiàn)。根據(jù)化合物的特征碎片離子,推測出11個