阿德福韋酯抗病毒治療病毒免疫學(xué)及與療效的關(guān)系.pdf

1、研究背景和目的：
　　 慢性乙型肝炎抗病毒治療的療效受由宿主免疫、病毒、肝臟微環(huán)境三個(gè)方面影響。核苷（酸）類似物（NA）通過(guò)抑制病毒合成來(lái)清除控制病毒，抑制病毒載量在低拷貝水平，但不能徹底清除病毒，僅有部分患者實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)應(yīng)答，而能否實(shí)現(xiàn)HBV病毒的完全清除，取決于宿主免疫應(yīng)答功能的強(qiáng)弱。
　　 核苷（酸）類似物抗病毒治療的研究，發(fā)現(xiàn)NA抑制病毒，病毒載量下降后，部分患者出現(xiàn)HBV特異性T細(xì)胞功能的一過(guò)性增強(qiáng)，并

2、且與HBeAg陰轉(zhuǎn)密切相關(guān)。慢乙肝患者急性發(fā)作，自發(fā)HBeAg血清轉(zhuǎn)換前，可出現(xiàn)HBcAg特異的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的顯著增強(qiáng)。這提示抗病毒治療能否實(shí)現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換，是與HBV特異性T細(xì)胞功能的恢復(fù)程度相關(guān)。因此，核苷（酸）類似物治療CHB患者,其治療前后的病毒免疫表達(dá)狀態(tài)，相互間的作用，與HBeAg陰轉(zhuǎn)的相關(guān)性是抗病毒治療免疫學(xué)機(jī)制的重要內(nèi)容。
　　 肝臟是HBV主要的受累器官，在肝臟局部的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等是抗病毒治療

3、的主要效應(yīng)因子，抗病毒治療后，肝臟局部的病毒清除、免疫細(xì)胞、免疫因子的數(shù)量和功能的改變對(duì)抗病毒的療效起了重要作用。充分闡明肝臟局部抗病毒治療的病毒免疫學(xué)機(jī)制，尋求理想的治療方法提高療效具有重大意義。
　　 1．動(dòng)態(tài)觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者，其外周血和肝臟局部病毒的清除動(dòng)力學(xué)：（1）外周血HBVDNA、HbeAg水平的動(dòng)態(tài)變化，與臨床療效的相關(guān)性（2）比較抗病毒治療的病毒動(dòng)力學(xué)的早期階段（0-12周），

4、HBeAg陰轉(zhuǎn)患者和HBeAg未陰轉(zhuǎn)患者在治療前后肝臟病毒（HBVDNA和cccDNA）載量的差異；對(duì)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的直接影響。
　　 2．動(dòng)態(tài)觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者，伴隨病毒下降的過(guò)程，宿主外周血和肝臟局部特異性和非特異性免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變（1）外周血HBV特異性T細(xì)胞功能、Treg細(xì)胞以及NK細(xì)胞活化受體NKG2D表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，（2）肝臟局部免疫細(xì)胞和免疫因子在病毒動(dòng)力學(xué)早期階段的改變，

5、進(jìn)一步探討抗病毒治療后免疫功能恢復(fù)的機(jī)制，與HbeAg血清學(xué)應(yīng)答的相關(guān)性。
　　 3．評(píng)估治療前病毒免疫狀態(tài)和早期病毒學(xué)應(yīng)答對(duì)遠(yuǎn)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，以進(jìn)一步闡明臨床抗病毒治療預(yù)測(cè)指標(biāo)的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　 研究方法：
　　 入選13例HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者，符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)及肝病分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均予阿德福韋酯治療10mg/天，隨訪治療1年。在治療前、治療后

6、2W、4W、8W、12W、16W、20W、24W、36W、50W留取肝素抗凝全血作為隨訪檢測(cè)標(biāo)本，部分全血分離外周血單核細(xì)胞凍存，分批進(jìn)行檢測(cè)。其中8例患者治療前和治療后12周各行肝活檢一次，留取肝組織樣本進(jìn)行檢測(cè)。
　　 1．監(jiān)測(cè)抗病毒治療過(guò)程血清HBV-DNA、HBeAg的水平，BrdU淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)隨訪時(shí)間點(diǎn)的T細(xì)胞增殖率，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)分泌干擾素-γ的HBV特異性CD4+T細(xì)胞頻數(shù)，以評(píng)價(jià)抗病毒治療后病毒

7、的下降對(duì)HBV特異性T細(xì)胞功能的影響。
　　 2．多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗病毒治療過(guò)程，CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量和NK細(xì)胞活化受體NKG2D的表達(dá)。
　　 3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)治療前和治療后12周肝臟組織病毒（cccDNA、HBVDNA）載量，比較治療前后肝臟組織病毒的下降程度。
　　 4．免疫組化法分析治療前和治療后12周肝臟組織免疫細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞）和細(xì)胞因子干擾素-

8、γ的動(dòng)態(tài)表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分
　　 1．臨床療效：阿德福韋酯有效的抑制了CHB患者的病毒復(fù)制，治療50周時(shí)，13例患者有9例血清HBVDNA低于檢測(cè)值下（9/13,69％）；有4例出現(xiàn)HBeAg的陰轉(zhuǎn)（4/13，30％），其中2例出現(xiàn)Anti-Hbe，實(shí)現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換（2/13，15％）。將患者分為HBeAg陰轉(zhuǎn)組和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組兩組，至36周和50周時(shí)，HBeAg陰轉(zhuǎn)組血清HBVDNA下降較H

9、BeAg未陰轉(zhuǎn)組顯著（P=0.025，P=0.022）。
　　 2.伴隨病毒載量的下降，HBeAg陰轉(zhuǎn)組治療后抗原特異性CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ能力較治療前增強(qiáng)（P＜0.05），分別在治療12周和出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)時(shí)達(dá)到高峰，而HBeAg未陰轉(zhuǎn)組治療后較治療前無(wú)顯著增強(qiáng)。與HBeAg未陰轉(zhuǎn)組比較，在治療前和治療后各隨訪點(diǎn)，HBeAg陰轉(zhuǎn)組HBV抗原特異性CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ能力都較前者顯著增強(qiáng)。HBeAg陰轉(zhuǎn)組治療后

10、HBV抗原特異性T細(xì)胞增殖能力有一過(guò)性增強(qiáng)，而HBeAg未陰轉(zhuǎn)組無(wú)T細(xì)胞增殖應(yīng)答。表明病毒載量下降后，HBV特異性T細(xì)胞功能恢復(fù)的患者，可實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)應(yīng)答。
　　 3.伴隨血清HBV-DNA的下降，Treg在0-4周間有明顯下降，4周后處于穩(wěn)態(tài)，不再下降；HBV-DNA和Treg之間呈正相關(guān)性趨勢(shì)（r=0.808，P=0.000）；在HBeAg轉(zhuǎn)換組和HBeAg未轉(zhuǎn)換組間下降趨勢(shì)和幅度沒(méi)有顯著差異。
　　 4.N

11、K細(xì)胞活化受體NKG2D在治療后8周開(kāi)始上升，12周時(shí)增高已有顯著性差異（8.12±4.74vs3.95±1.15，P=0.009）；50周較基線值顯著增加(17.52±6.81vs3.95±1.15，P=0.000)，約增加了5倍。NKG2D和HBVDNA、HBeAg間呈負(fù)性相關(guān)趨勢(shì)（分別是r=-0.734，P=0.000；r=-0.878，P=0.000）。HbeAg陰轉(zhuǎn)組和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組在各個(gè)時(shí)間隨訪點(diǎn)變化趨勢(shì)和增加幅度一致，

12、二者間無(wú)顯著差異。
　　 第二部分
　　 1.治療12周后肝組織總HBVDNA減少量為86.22％-99.69％，平均97.98％；肝組cccDNA減少量為88.16％-99.98％，平均97.82％。由此可見(jiàn)， 近98％左右的肝臟病毒載量在治療的早期被清除。同步比較治療前后外周血HBVDNA（12周vs0周：2.81×104vs1.00×107）平均降低99.72％，肝臟局部和外周血病毒的清除動(dòng)力學(xué)相一致。
　　

13、 2．治療前HBeAg陰轉(zhuǎn)組的肝組織HBV DNA和cccDNA水平均低于HBeAg未陰轉(zhuǎn)組（HBV DNA：2.39×108vs5.67×108 copies/ug；cccDNA：4.77×104vs7.98×104 copies/ug）,治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)組的cccDNA水平低于HBeAg未陰轉(zhuǎn)組（5.50×102vs1.93×103）。這提示治療前肝組織HBVDNA和cccDNA載量較低或治療后肝組織cccDNA明顯下降的患者

14、，其遠(yuǎn)期實(shí)現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)的機(jī)會(huì)較高。
　　 3．所有患者治療后（12周）較治療前（0周）肝臟炎癥明顯減輕，匯管區(qū)縮小，淋巴單核浸潤(rùn)細(xì)胞減少。肝小葉點(diǎn)狀壞死、碎屑樣壞死、橋形壞死不同程度減輕。部分患者纖維化改善?？共《局委熀?，病毒合成被抑制，肝組織炎癥纖維化明顯好轉(zhuǎn)。
　　 4．部分患者治療后肝組織CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的平均陽(yáng)性面積和匯管區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較治療前增加。3例HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者，有1例CD4+T/CD8+T

15、/NK細(xì)胞數(shù)治療后均較治療前增加，另外2例CD8+T/NK細(xì)胞數(shù)較治療前增加；5例HBeAg未陰轉(zhuǎn)患者僅1例CD8+T/NK細(xì)胞數(shù)較治療前增加。這提示治療后肝組織免疫效應(yīng)細(xì)胞的增加，促使抗病毒免疫功能的恢復(fù)，有利于HBeAg的陰轉(zhuǎn)。
　　 5．治療后肝組織IFN-γ的表達(dá)量較治療前下降（12周vs0周：1282.49±528.32vs2012.49±971.53，P=0.031）。IFN-γ的表達(dá)和CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)性（pe

16、arson 檢驗(yàn)R=0.591， P=0.026）
　　 結(jié)論：
　　 1.抗病毒治療的早期階段，肝臟組織有約97％的病毒（HBVDNA和cccDNA）被清除，與外周血病毒清除動(dòng)力學(xué)一致。治療前肝組織HBVDNA和cccDNA的低表達(dá)，以及治療12周時(shí)cccDNA的顯著清除均有利于宿主HbeAg的陰轉(zhuǎn)。
　　 2.阿德福韋酯抗病毒治療，病毒抑制，炎癥減輕，HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者早期免疫功能的恢復(fù)與肝臟局部CD8+T