人神經(jīng)肽Y Y5受體的克隆表達(dá)及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、目前，肥胖已成為全球性的影響人類(lèi)生活質(zhì)量和壽命的最大威脅，是Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、高血壓、中風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎以及一些特殊類(lèi)型癌癥等疾病的主要誘因。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)全球有10億成人體重超標(biāo)，其中至少有3億是肥胖患者；在我國(guó)，超重和肥胖人口也分別達(dá)到2億和6000萬(wàn)。因此，肥胖已成為當(dāng)前亟待解決的重大醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究水平的提高，科學(xué)家們普遍認(rèn)為神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y,NPY)與肥胖的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。NPY

2、是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)食欲增強(qiáng)因子，在腦尤其是室旁核中，無(wú)論是內(nèi)源性還是外源性NPY都能刺激動(dòng)物攝食?，F(xiàn)已證實(shí)，NPY對(duì)進(jìn)食行為的這種調(diào)節(jié)功能是在NPY Y5受體(Neuropeptide Y Y5 Reeeptor,NPY5R)的介導(dǎo)下完成的，多種NPY5R激動(dòng)劑均可誘導(dǎo)進(jìn)食行為，NPY5R基因的反義寡核苷酸腦室注射可特異阻斷下丘腦NPY5R基因的翻譯，進(jìn)而減少正常大鼠與肥胖大鼠的進(jìn)食次數(shù)、延長(zhǎng)它們的進(jìn)食周期并減少其進(jìn)食量，最終導(dǎo)致減肥

3、降脂。這暗示著NPY5R與肥胖的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并可作為一個(gè)治療肥胖的潛在的藥物靶標(biāo)，而NPY5R抑制劑必將成為治療肥胖和飲食混亂的理想藥物。因此，通過(guò)分子生物學(xué)手段克隆表達(dá)純化獲得人NPY5R(hNPY5R)蛋白，并針對(duì)該蛋白構(gòu)建高通量篩選模型，篩選NPY5R的抑制劑，將有助于治療肥胖藥物的開(kāi)發(fā)。 本研究根據(jù)GenBank公布的hNPY5R基因編碼序列(GeneID：4889)設(shè)計(jì)引物，以人基因組為模板，PCR獲得hNPY5

4、R編碼序列，PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)過(guò)酶切連接克隆至表達(dá)載體pESP2中，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pESP2-hNPY5R通過(guò)CaCl2法轉(zhuǎn)入宿主菌E．coli JM109中；菌落PCR、酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒；將鑒定正確的重組質(zhì)粒pESP2-hNPY5R電轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01，然后對(duì)經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破菌后12％SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白大小的條帶不明顯，初步推測(cè)該融合蛋白對(duì)宿主菌有較強(qiáng)毒性，從而

5、導(dǎo)致該蛋白的表達(dá)水平低下。 根據(jù)hNPY5R基因編碼序列設(shè)計(jì)另外一對(duì)引物，PCR得到hNPY5R編碼序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-hNPY5R，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，菌落PCR驗(yàn)證后對(duì)重組菌進(jìn)行終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)，測(cè)其OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線；同時(shí)進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組融合蛋白大小的條帶不明顯，由此初步認(rèn)為該融合蛋白對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)有抑制作用，可能有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，重組菌誘導(dǎo)

6、后的生長(zhǎng)曲線的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。本論文應(yīng)用VectorNT9.0、SignalP、ClustalX1.83等生物信息學(xué)軟件對(duì)人NPY、NPY5R進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)、信號(hào)肽、親/疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)等的分析；通過(guò)網(wǎng)上預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的服務(wù)器PSIPRED(Position Specific Iterated PRED)Server(http//bioinf．cs．ucL.ac．uk/prispred/)對(duì)hNPY5R蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分