皮肌炎患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)性狀的研究.pdf

1、目的： 通過比較皮肌炎(dermatomyositis，DM)患者與正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow—derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的生物學(xué)性狀，探討DM患者BMSCs是否存在缺陷或變異，能否應(yīng)用于自體移植，抑或DM本身就是一種干細(xì)胞疾病，與DM的發(fā)病相關(guān)，從而為DM患者BMSCs自體移植的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．分別采集5例DM患者與正常入骨髓各

2、5ml-8ml，用密度梯度離心及貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)、傳代，流式細(xì)胞儀鑒定P3代BMSCs的表面標(biāo)志。 2．兩組人群BMSCs增殖能力的比較：MTT法測定P3、P6代BMSCs生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間；流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，計(jì)算增殖指數(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time Polymerase chain reaction，RT—PCR)測定端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse tr

3、anscriptase，hTERT)的表達(dá)。 3．兩組人群BMSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化能力的比較：將P3代細(xì)胞分別在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液(H—DMEM培養(yǎng)液+10％胎牛血清+100u/ml青霉素+100pg/ml鏈霉素+10ng/ml VEGF+5ng/ml bFGF)中培養(yǎng)，并將L—DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)的正常人BMSCs做為陰性對(duì)照，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)，14d時(shí)免疫組織化學(xué)檢測Ⅷ因子的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測

4、 CD34、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(kinase—insert domain conteining receptor，KDR)表達(dá)的情況，從而鑒定BMSCs原性內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)果： 1．兩組人群均可成功分離、培養(yǎng)得到BMSCs，在P3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上未見明顯差異，細(xì)胞貼壁后形態(tài)均一，長梭形或多角形，呈平行、旋渦狀、輻射狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD34、CD45陰性，CD44陽性，CD71弱陽性，鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞。

5、 2．兩組人群BMSCs增殖能力的比較：正常對(duì)照組P3代時(shí)細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(4.73±0.31)d，DM組為(4.76±0.32)d，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05：P6代時(shí)正常對(duì)照組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(5.74±0.35)d，DM組為(6.14±0.34)d，DM組BMSCs群體倍增時(shí)間長于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。正常對(duì)照組P3代BMSCs增殖指數(shù)為(17.87±2.05)％，DM組為(17.12±2.

6、00)％，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；P6代正常對(duì)照組BMSCs增殖指數(shù)為(10.73±1.78)％，DM組為(5.96±2.16)％，DM組增殖指數(shù)小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。正常對(duì)照組P6代BMSCs hTERT表達(dá)量為(10.63±1.49)，DM組為(6.45±2.04)，DM患者h(yuǎn)TERT表達(dá)水平較正常對(duì)照組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 3．兩組細(xì)胞均在誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后免疫組化

7、檢測Ⅷ因子的表達(dá)為陽性，流式細(xì)胞儀檢測KDR、CD34表達(dá)為陽性，DM組與對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)CD34相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。DM組與對(duì)照組細(xì)胞相比表達(dá)KDR較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這可能與樣本量較少有關(guān)，也可能是由于DM本身BMSCs異常所致。 結(jié)論： 1．兩組人群均可成功分離、培養(yǎng)得到BMSCs，且DM患者與正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異； 2．DM患者BMSCs在不同程度上存在缺陷；