小鼠成體肝臟祖細胞(AHPC)體外培養(yǎng)模型的建立和生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：
　　 研究正常成體小鼠肝細胞的增殖能力和分化潛能,分離正常成體小鼠肝臟內(nèi)可能存在的干細胞或祖細胞并建立體外培養(yǎng)的細胞模型,研究其基本的生物學(xué)特性。
　　 方法：
　　 應(yīng)用改良的Seglen二步法灌注和離心分離肝臟細胞,將肝細胞初步分為肝臟實質(zhì)細胞(parenchymalhepatocytes,PH)部分和富含AHPC(adulthepaticprogenitorcells,AHPC)部分,對兩部分的細胞

2、用添加胎牛血清(FBS)的改良DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),持續(xù)觀察超過60天,分析兩部分中肝細胞的形態(tài)學(xué)差異,以及通過細胞增殖和克隆的形成情況分析兩部分中肝細胞增殖能力的差異。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對具有高增殖能力細胞及其形成的克隆進行Albumin、AFP、CK19、c-kit、CD45、CD34、Oct-4、Desmin、CD16、Thy-1和nestin等染色,分析細胞標記物的表達和克隆內(nèi)細胞的成熟分化情況。利用形態(tài)學(xué)觀察、記錄細胞增殖狀況

3、,以及免疫熒光染色技術(shù)初步分析肝臟非實質(zhì)細胞(nonparenchymalcell,NPC)的生長對于AHPC活化、增殖和分化的影響。另外,嘗試了AHPC克隆的傳代培養(yǎng)。
　　 結(jié)果：
　　 本研究中兩部分肝細胞均獲得較高的產(chǎn)量和活性(＞90％),完全滿足實驗的需要。PH部分和富含AHPC部分的肝細胞大小分別為(37.03±6.65)μm和(22.63±2.04)μm,存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05),但在大小分布比

4、例上存在小部分的重疊。兩部分的貼壁細胞中均含有NPC污染,其中富含AHPC部分較多,占貼壁細胞總數(shù)的70.3％,NPC增殖后肝細胞活化并開始增殖,所有的肝細胞克隆均表達肝星狀細胞標記物Desmin。富含AHPC部分的肝細胞增殖能力明顯較PH部分高,兩部分的克隆形成率分別為21.45％±1.25％和0.28％±0.09％(p＜0.001)。富含AHPC部分中,約13.5％的貼壁肝細胞在接種后第2～3天活化并迅速增殖,第4～5天形成小的細胞

5、克隆,極少數(shù)細胞(0.5％～1％)在接種后第3天即可形成克隆;培養(yǎng)30天后克隆內(nèi)出現(xiàn)類似成熟的肝細胞,細胞克隆可持續(xù)擴增超過60天,最大克隆面積達到0.64mm2,細胞平均增殖超過10個周期。貼壁后24小時,所有的肝細胞均強陽性表達肝細胞標記物Albumin,不表達AFP和CK19,培養(yǎng)第5天細胞克隆開始表達Albumin和AFP,第30天克隆內(nèi)部分細胞表達膽管細胞標記物CK19,同時發(fā)現(xiàn)Albumin陰性細胞。通過免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn),培

6、養(yǎng)第30天,AHPC克隆內(nèi)同時存在Albumin陽性和AFP陽性、Albumin陽性和AFP陰性、Albumin陽性和CK19陰性、CK19陽性和AFP陰性、CK19陽性和AFP陽性的細胞。另外,AHPC可以傳代培養(yǎng)超過60天,傳代培養(yǎng)中,貼壁的AHPC克隆內(nèi)細胞較小,核漿比率大,呈上皮樣細胞的形態(tài),部分細胞仍然具有獨立形成克隆的能力,但觀察發(fā)現(xiàn),AHPC克隆解離為細胞團進行傳代培養(yǎng)中細胞的增殖比解離為單細胞傳代好。
　　 結(jié)論

7、：
　　 1.在正常成體小鼠肝臟內(nèi)存在一種肝臟組織特異性的成體肝臟祖細胞(AHPC),并已成功建立了體外培養(yǎng)的細胞模型。
　　 2.小鼠AHPC體外培養(yǎng)活化后可持續(xù)克隆性增殖超過60天,并可連續(xù)傳代培養(yǎng),具有向肝細胞和膽管細胞分化的雙向分化潛能。
　　 3.肝臟非實質(zhì)細胞(NPC)的生長可以促進AHPC的增殖、成熟和分化。
　　 4.與國外文獻報導(dǎo)的肝臟祖細胞相比,小鼠AHPC體外培養(yǎng)中細胞表型不同,具有