應(yīng)用光遺傳學(xué)技術(shù)精確激活大鼠中腦導(dǎo)水管周灰質(zhì)背側(cè)區(qū)誘發(fā)防御行為的研究.pdf

1、中腦導(dǎo)水管周灰質(zhì)(PAG)被認為是調(diào)節(jié)恐懼、焦慮等負面情緒和防御性行為的最終神經(jīng)通路。其中，中腦導(dǎo)水管周灰質(zhì)背側(cè)區(qū)(dPAG)主要負責(zé)主動性的防御行為。然而，電刺激與化學(xué)刺激作為傳統(tǒng)的腦刺激方式，無法做到同時在時間和空間上達到精確可控，這給dPAG相關(guān)的神經(jīng)功能研究及動物行為的精確控制帶來了不利影響。近年來，光遺傳學(xué)展示了其在激活或者抑制可興奮細胞方面驚人的前景:當(dāng)被適當(dāng)波長的光照射時，光敏感離子通道打開，造成細胞膜的去極化，產(chǎn)生動作電

2、位。這種基于光遺傳學(xué)的技術(shù)同時擁有優(yōu)異的時間和空間可控性，并且最大程度的規(guī)避了非特異性的激活或抑制。因此，選擇性的使目標(biāo)區(qū)域的神經(jīng)元表達光敏感蛋白，即可達到對特定區(qū)域神經(jīng)元特異性的控制，這為精確研究大鼠dPAG功能及在人為誘發(fā)大鼠產(chǎn)生防御性行為方面提供了新的方法。
　　本研究擬利用光遺傳學(xué)技術(shù)，精確激活大鼠dPAG核團，進而考察①有效光刺激強度是否與非條件反射的防御行為強度相關(guān);②光刺激與電刺激誘發(fā)大鼠防御性行為的差異及產(chǎn)生差異的

3、原因;③光刺激與電刺激激活中腦的范圍;④dPAG內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元在防御性行為中的作用。
　　本研究內(nèi)容及創(chuàng)新點主要為:
　?、俳⒘朔€(wěn)定的病毒包裝、濃縮、純化體系，成功的包裝了AAV、LV，并進行了純化濃縮，得到高滴度的一次感染性病毒顆粒（高達～109顆粒/ml的LV、～1013顆粒/ml的AAV）用于感染大鼠dPAG神經(jīng)元。
　　②建立了完整的光刺激系統(tǒng)用于穩(wěn)定誘發(fā)大鼠僵直行為和逃跑行為。光刺激的同時使用Plexon

4、系統(tǒng)進行電記錄，確認了dPAG中ChR2陽性神經(jīng)元的激活與激光的頻率、強度相關(guān)，反映了動作電位的發(fā)放頻率和FSL兩者結(jié)合可以一定程度的反應(yīng)大鼠對dPAG刺激的響應(yīng)程度，揭示神經(jīng)元的時域、頻域編碼方式;
　?、蹖Ρ攘嗽诠獯碳ず碗姶碳ふT發(fā)大鼠的行為差異，說明了光刺激比電刺激在誘發(fā)防御行為方面更加溫和可靠;
　　④通過腦片c-fos免疫染色，確認了兩種刺激方式激活中腦的范圍差異，繼而使用逆行性及順行性神經(jīng)元追蹤染料，確認其他核團的