大豆miR172及靶基因參與開花誘導(dǎo)和逆境響應(yīng)的功能分析.pdf

1、大豆最初起源于我國(guó)，距今已有5000多年歷史，目前在世界范圍內(nèi)均有廣泛栽培。大豆所提供的植物蛋白和油分可以滿足人們的大部分需求，是重要的糧油兼用作物，因此大豆逐漸成為了各個(gè)國(guó)家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的重要組成。大豆對(duì)光照等自然條件比較敏感，因此大豆品種的跨區(qū)域種植受到限制，進(jìn)而影響大豆的總體面積和產(chǎn)量。干旱、鹽堿等非生物脅迫會(huì)在大豆生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期對(duì)其造成威脅，進(jìn)而引起作物產(chǎn)量的大幅度降低。為了擴(kuò)大我國(guó)大豆的種植區(qū)域，改善大豆品種的適應(yīng)性，進(jìn)

2、而增加大豆產(chǎn)量，首先要降低大豆開花對(duì)光的敏感性，使其在大部分區(qū)域都能夠正常開花，成熟;更要提高大豆品種在逆境脅迫下的抵抗能力，使其在相對(duì)惡劣的環(huán)境下也能保持穩(wěn)產(chǎn)甚至高產(chǎn)。
　　microRNA(miRNA)是動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在的一種不具有編碼功能的小分子RNA，一般只有20～24個(gè)核苷酸大小。不同于傳統(tǒng)的基因，miRNA的功能主要是通過引起靶基因mRNA的降解或者阻礙靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因的功能受到抑制。最近的研究顯

3、示，miRNA不但在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)發(fā)生等過程中發(fā)揮了重要的作用，而且廣泛參與了植物對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)的應(yīng)答過程。miR172是一個(gè)保守的miRNA家族，在許多植物中已經(jīng)得到報(bào)道與研究。大部分研究已經(jīng)證實(shí)miR172在植物花期確定和花器官形成方面的重要作用。AP2-like基因家族作為開花時(shí)間調(diào)控的抑制因子，已經(jīng)被證實(shí)是miR172的靶基因。近期的研究發(fā)現(xiàn)miR172可能在植物應(yīng)答環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮了作用。小麥的miR172可以被滲透

4、脅迫、鹽及低溫所誘導(dǎo)，而在水稻中，干旱則可以明顯降低miR172的表達(dá)。
　　本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)以東農(nóng)42為試驗(yàn)材料，分析了大豆gma-miR172a及其靶基因Glyma03g33470的時(shí)空特異性表達(dá)情況。通過gma-miR172a轉(zhuǎn)基因擬南芥、toe1恢復(fù)擬南芥分析驗(yàn)證其在植物開花誘導(dǎo)中的作用。同時(shí)，我們同樣利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析了東農(nóng)50大豆中g(shù)ma-miR172c及其靶基因Glyma01g39520在PEG

5、、NaCl以及脫落酸處理下的表達(dá)模式，通過gma-miR172c在模式植物擬南芥中過量表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行逆境脅迫處理和基因表達(dá)分析，揭示了大豆gma-miR172c在植物逆境響應(yīng)中的基本功能，主要結(jié)果如下:
　　1.Real-time RT-PCR分析表明，gma-miR172a的表達(dá)水平會(huì)隨著大豆的生長(zhǎng)發(fā)育而提高，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)末期，花芽形成初期達(dá)到峰值;gma-miR172a的表達(dá)具有組織特異性。
　　2.5'RACE實(shí)

6、驗(yàn)表明gma-miR172a在體內(nèi)可以直接切割Glyma03g33470; Real-timeRT-PCR分析表明Glyma03g33470的表達(dá)也具有時(shí)空特異性。
　　3.利用pCAMBIA3301-gma-miR172a載體轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)PPT篩選、PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)獲得純合的T3代gma-miR172a轉(zhuǎn)基因擬南芥株系;利用pCAMBIA3301-rGlyma03g33470載體轉(zhuǎn)化toe1擬南芥突變體，經(jīng)PPT篩選

7、、PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)獲得T3代toe1恢復(fù)擬南芥株系。
　　4.過表達(dá)gma-miR172a擬南芥表現(xiàn)為花期提前、葉片數(shù)減少，toe1突變體恢復(fù)擬南芥花期介于野生型和toe1突變體之間。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，gma-miR172a可以通過提高FT、AP1和LFY的表達(dá)從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥早花。
　　5.Real-time RT-PCR分析表明GmGIa過表達(dá)大豆體內(nèi)gma-miR172a的成熟序列、GmDCL1和Gm

8、SE的表達(dá)水平高于東農(nóng)50大豆，證實(shí)GI可以通過參與大豆miR172a的成熟過程影響其豐度。
　　6.Real time RT-PCR分析表明gma-miR172c可以被脫落酸(ABA)、干旱和NaCl誘導(dǎo)表達(dá)。
　　7.5'RACE實(shí)驗(yàn)表明gma-miR172c在大豆體內(nèi)可以直接切割Glyma01g39520;Real-time RT-PCR分析表明Glyma01g39520的表達(dá)也受ABA、干旱和NaCl的影響。

9、　　8.利用pCAMBIA3301-gma-miR172c載體轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)PPT篩選、PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)獲得純合的T3代gma-miR172c轉(zhuǎn)基因擬南芥株系;利用pCAMBIA3301-rGlyma01g39520載體轉(zhuǎn)化snz突變體，經(jīng)PPT篩選、PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)獲得T3代snz/35S∷rGlyma01g39520擬南芥株系。
　　9.在擬南芥中，過表達(dá)gma-miR172c提高了植株在干旱和鹽脅迫下的萌

10、發(fā)率、子葉綠化率、根長(zhǎng)和存活情況。同時(shí)，gma-miR172c過表達(dá)擬南芥對(duì)外源ABA更加敏感。gma-miR172c轉(zhuǎn)基因株系離體葉片水分喪失較慢。而且，過表達(dá)gma-miR172c株系中脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平、SOD酶活性和脯氨酸含量顯著提高。以上結(jié)果表明，gma-miR172c在擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)中是一個(gè)正調(diào)控因子。
　　10.經(jīng)表型分析發(fā)現(xiàn)gma-miR172c過表達(dá)擬南芥在干旱脅迫下開花提前明顯。
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