中藥復方更年春對β-淀粉樣蛋白致PC12細胞損傷的保護作用.pdf

1、婦女進入圍絕經(jīng)期以后,卵巢功能減退,出現(xiàn)了血管舒縮癥狀、神經(jīng)精神癥狀,以及骨質疏松、學習記憶力減退,甚至發(fā)生阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)。對于AD的治療尚處于對癥階段,雌激素和中醫(yī)藥在AD防治中的作用正在引起重視。雌激素替代治療同時增加了子宮內膜癌、乳腺癌、心臟疾患和中風等的發(fā)病風險,故受到限制。中醫(yī)中藥對由雌激素下降引起的圍絕經(jīng)期綜合征有較好的療效,因此中醫(yī)中藥對于雌激素下降有關的學習記憶能力減退甚至A

2、D可能有良性調節(jié)作用。
　　 我院根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實踐,以滋腎柔肝清心瀉火為治則制成以補腎為主更年春方(GNC),對更年期綜合征療效良好,尤其可以改善大腦功能、增強記憶能力。既往研究發(fā)現(xiàn),GNC可通過提高雌激素受體(ER)含量對神經(jīng)內分泌免疫網(wǎng)絡起良性調節(jié)作用;GNC可以提高大鼠切除卵巢后Morris水迷宮成績;GNC可提高海馬中Erβ mRNA和蛋白的表達、調節(jié)海馬膽堿能指標并可能由此改善學習和記憶能力;而且GNC不導致

3、子宮內膜增生,提示中藥GNC對改善學習和記憶能力有潛在的應用前景。
　　 本研究擬通過體外實驗研究,解析GNC復方及主要單體成分對神經(jīng)細胞損傷的保護作用及其分子機制。
　　 第一部分 中藥GNC對PCI2細胞的保護作用
　　 目的：探討、分析中藥GNC含藥血清和主要單體及其復合物對PC12細胞作用的有效濃度及時間。
　　 方法：3月齡SD雌性大鼠去勢后隨機分組,分別以中藥復方GNC顆粒制劑或生理鹽水灌服,

4、制備GNC含藥血清及正常大鼠血清。以GNC含藥血清、正常大鼠血清、F-12培養(yǎng)基(含5％FBS+15％HS,作為空白對照)、GNC復方中主要單體成分芍藥苷(Pae)、黃連素(Ber)、知母皂苷A-Ⅲ(Tim)、淫羊霍苷(Ica)及其復合物處理PC12細胞。MTT法檢測細胞增殖活力。摸索中藥含藥血清作用的有效濃度及時間;摸索四種中藥單體及復合物(Ica+Tim+Pae+Ber)作用的有效濃度及時間。
　　 結果MTT法顯示:不同濃

5、度GNC含藥血清培養(yǎng)PC12細胞24h、48h、72h后,均表現(xiàn)在20％濃度對PC12細胞活力的促進作用最強,隨著培養(yǎng)PC12細胞的GNC含藥血清濃度下降,細胞活力呈逐漸減弱趨勢;與正常大鼠血清、空白對照比較,20％GNC含藥血清培養(yǎng)PC12細胞24、48、72小時后細胞活力均明顯增強。與空白對照比較,各中藥單體及單體復合液培養(yǎng)PC12細胞24小時后,細胞活力無明顯差異,但Ber在濃度為1umol/L和中藥單體復合物在濃度梯度3(含Be

6、r 1umol/L、Tim 1umol/L、Pae 1g/L、Ica 1ng/ml)培養(yǎng)細胞時活力似有升高趨勢。
　　 結論：在本研究比較的各不同濃度GNC血清中,20％GNC血清為GNC作用PCI2細胞最適有效劑量;處理24小時可作為GNC含藥血清作用PCI2細胞有效時間。
　　 第二部分 Aβ25-35導致PC12細胞損傷
　　 目的：探討并分析Aβ25-35導致PC12細胞損傷的有效時間和劑量,以建立阿爾茨

7、海默病體外細胞模型,為后續(xù)解析GNC復方及主要單體成分保護神經(jīng)細胞免受損傷的作用及其分子機制奠定基礎。
　　 方法：應用不同濃度Aβ25-35處理PC12細胞24h、48h,MTT法測定細胞活力,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　 結果：終濃度分別為5、10、20、及40μmol/L的Aβ25-35培養(yǎng)PC12細胞24h、48h后,MTI法顯示的細胞活力均有明顯下降(P<0.01);且隨著Aβ 25-35濃度增加或培養(yǎng)時間延

8、長,細胞活力有明顯減弱趨勢。倒置相差顯微鏡觀察:對照組細胞密集,細胞間連接緊密,細胞有立體感;在Aβ25-35作用下,有活力細胞數(shù)目減少,細胞間連接較松,胞漿較暗淡,細胞碎片較多,貼壁細胞欠透明,部分發(fā)生皺縮,胞漿中有較多顆粒。
　　 結論：Aβ25-35有明顯劑量、時間依賴性地抑制PC12細胞活力作用;采用20μmol/l的Aβ處理。PC12細胞24小時可制備AD體外模型。
　　 第三部分 中藥GNC方對Aβ誘導PC1

9、2細胞損傷的保護作用及其細胞內信號通路
　　 目的：探討GNC方是否能明確改善神經(jīng)細胞凋亡?GNC復方哪些成分是保護神經(jīng)細胞免受損傷的主要成分?GNC方有無提高ER亞型、起到類似SERM的作用?GNC方是否能激活MAPK信號轉導途徑?
　　 方法：設置7個實驗組:(1)對照組;(2)Aβ(模型)組;(3)正常大鼠血清組;(4)GNC含藥血清組;(5)Ber組;(6)中藥單體復合物組;(7)NGF(陽性對照)組。其中(1)

10、組細胞以常規(guī)培養(yǎng)基(F-12培養(yǎng)基:含5％FBS+15％HS)與其它各組同步培養(yǎng);(2)組與(3)-(7)組同步加入Aβ25-35(20umol/L),不加其它藥;(3)-(7)組在細胞傳代進人對數(shù)生長期后(24h左右)分別加藥,其中(3)-(6)組加藥的濃度根據(jù)第一部分摸索的最適濃度加上,(7)組加入終濃度為10 mg/L的NGF。(3)-(7)組分別于加藥2小時后加Aβ25-35(20umol/L),繼續(xù)分別培養(yǎng)24小時,MTT檢測

11、細胞活力,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,Westem-blotting檢測PC12細胞caspase-3、bax和bcl-2、p-ERK1/2、ER亞型蛋白表達。
　　 結果：MTT法檢測細胞活力顯示:與Aβ處理的模型組比較,GNC含藥血清組、Ber組、中藥單體復合物組、NGF組的細胞活力均明顯增強(P<0.01);中藥單體復合物組及Ber組細胞活力均明顯低于GNC含藥血清組(P<0.05和P<0.01);中藥單體復合物組細胞活力明

12、顯高于Ber組比較,(P<0.05)。
　　 Atmexin V-FITC/PI雙標記FCM分析PC12細胞早期凋亡顯示:與Aβ模型組比較,GNC含藥血清組、Ber組、中藥單體復合物組、NGF組的PC12細胞早期凋亡率均明顯下降(P<0.01);中藥單體復合物組及Ber組的PC12細胞早期凋亡率均明顯高于GNC含藥血清組(P<0.01);中藥單體復合物組FCM測得PC12細胞早期凋亡率明顯低于Ber組(P<0.01)。Weste

13、rn-blotting結果顯示,GNC含藥血清、NGF處理的PCI2細胞凋亡抑制基因bcl-2表達水平明顯高于促凋亡基因bax;中藥單體復合物對PC12細胞抑凋亡基因bcl-2表達略高于促凋亡基因bax。各組caspase-3的表達量在Aβ組最高,正常大鼠血清組較Aβ組稍低,Ber組、中藥單體復合物組其次,NGF組、GNC含藥血清組明顯減低,NGF組最低。
　　 Western-blotting檢測結果還顯示:各組均未能測出Er

14、α蛋白條帶,提示Erα不參與對PC12細胞的保護作用。Erβ表達水平高低依次為:GNC含藥血清組、中藥單體復合物組、NGF組、Ber組、正常大鼠血清組、Aβ組。Western-blotting檢測結果還發(fā)現(xiàn):各組中p-ERK1/2含量高低依次為:GNC含藥血清組、NGF組、中藥單體復合物組、Ber組、正常大鼠血清組、Aβ組。
　　 結論：1.GNC含藥血清、Ber、中藥單體復合物均能抑制AB致PC12細胞凋亡,對AB致PC12細

15、胞的損傷有保護作用,其中GNC含藥血清作用最強,與NGF作用相仿。2.PC12細胞表達Erβ蛋白,但不表達Erα蛋白。GNC復方能明顯提高PC12細胞中Erβ表達。3.GNC復方能激活神經(jīng)細胞MAPK信號通路,提高PC12細胞p-ERK1/2的表達。
　　 第四部分 GNC方通過ER β保護PC12細胞免于損傷及其信號轉導機制
　　 目的：探討GNC復方是否通過ERK途徑介導抗凋亡作用;以及細胞內信號轉導途徑?
　

16、　 方法：實驗設置:(1)對照組;(2)Aβ組;(3)MAPK阻斷+GNC含藥血清組;(4)MAPK阻斷+中藥單體復合物組;(5)ER拮抗+GNC含藥血清組:(6)ER拮抗+中藥單體復合物組;(7)GNC含藥血清組;(8)中藥單體復合物組。分別培養(yǎng)24小時后,AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細胞儀(FCM)檢測PC12細胞早期凋亡;Western-blotting檢測各組PC12細胞caspase-3、bax和bcl-2蛋白

17、表達。分別培養(yǎng)10分鐘后,Western-blotting檢測PC12細胞p-ERK1/2表達水平,分析ER介導的細胞內信號轉導途徑。
　　 結果：與GNC含藥血清組比較,MAPK阻斷+中藥含藥血清組、ER拮抗+中藥含藥血清組的PC12細胞早期凋亡率均明顯增加(P<0.01);與中藥單體復合物組比較,MAPK阻斷+中藥單體復合物組、ER拮抗+中藥單體復合物組的PC12細胞早期凋亡率均明顯增加(P<0.01),提示中藥含藥血清及中

18、藥單體復合物均可通過ER及MAPK途徑抑制PC12細胞凋亡。Western-blotting檢測結果可以看出:中藥含藥血清組、中藥單體復合物組PC12細胞抑凋亡基因bcl-2含量明顯高于促凋亡的bax含量,MAPK阻斷+中藥含藥血清組、ER拮抗+中藥含藥血清組、MAPK阻斷+中藥單體復合物組、ER拮抗+中藥單體復合物組的PC12細胞中抑凋亡基因bcl-2含量明顯低于促凋亡的bax含量;且此4組中caspase-3的表達量也較中藥含藥血清

19、組、中藥單體復合物組明顯增加,說明中藥含藥血清及中藥單體抑制Aβ致PC12細胞凋亡的作用至少通過ER和MAPK途徑調節(jié)bax、bcl-2的表達。
　　 分析中藥提高ER含量與信號轉導途徑間的關系發(fā)現(xiàn):含藥血清組及中藥單體復合物組PC12細胞有一定量的p-ERK表達,含藥血清組p-ERK較中藥單體復合物組略多,加入ER拮抗劑后兩組PC12細胞均未測出p-ERK表達,提示中藥GNC提高p-ERK的表達至少有ER的參與。