膿腫分枝桿菌非溶血性磷脂酶C的克隆表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、目的：
　　克隆、表達(dá)膿腫分枝桿菌磷脂酶C基因，鑒定其活性，為進(jìn)一步探討該蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及其在膿腫分枝桿菌感染過程中的致病作用提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　方法：
　　以膿腫分枝桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增膿腫分枝桿菌磷脂酶C基因片段，克隆入pQE-30質(zhì)粒，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pQE-30-MAB_0555，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，進(jìn)行序列測定及利用生物信息學(xué)軟件DNAstar5.0等分析其生物學(xué)特性，同時(shí)IPT

2、G誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，采用SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量，應(yīng)用Western-blotting檢測蛋白表達(dá)，離子交換層析純化重組蛋白，杯碟法檢測其活性。
　　結(jié)果：
　　PCR擴(kuò)增獲得長1440bp的MAB_0555基因片段，編碼479個(gè)氨基酸，經(jīng)PCR、雙酶切及測序證明重組質(zhì)粒pQE-30-MAB_0555構(gòu)建正確。DNAstar等軟件預(yù)測其蛋白質(zhì)相對分子量(Mr)約為53KD，并顯示出具有良好的抗原性。SDS-PA

3、GE顯示表達(dá)蛋白相對分子量約為53KD，同生物信息學(xué)分析軟件所得的估計(jì)值一致；Western-blotting檢測蛋白得到表達(dá)，杯碟法觀察到在瓊脂卵黃平板上可見乳白色暈圈，而血平板上未見溶血環(huán)。
　　結(jié)論：
　　成功的克隆了膿腫分枝桿菌磷脂酶C基因和構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE-30-MAB_0555，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析出該蛋白具有良好的抗原性；同時(shí)應(yīng)用Western-blotting技術(shù)分析重組蛋白得到正確表達(dá)，并通過卵黃瓊脂平