美洲商陸抗真菌蛋白（PaAFP）基因在煙草及玉米中的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、PaAFP(P.americanaAntifungalProtein)是從美洲商陸(PhytolaccaamericanaL.)的種子中分離出的一種抗真菌蛋白。PaAFP從萌發(fā)的種子中釋放出來，形成抵抗病原菌的抑制區(qū)域，以抵擋微生物的危害。PaAFP具有強(qiáng)堿性，極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，富含6個(gè)半胱氨酸。該蛋白具有knottins折疊結(jié)構(gòu)，即一個(gè)小型3股反向平行β-折疊片，半胱氨酸序列結(jié)構(gòu)(C...C...CC...C...C)組成二硫鍵框架和其

2、采用的配對(duì)形式(1-4，2-5，3-6)。它對(duì)包括立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)在內(nèi)的多種絲狀真菌和革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用。目前還沒有將PaAFP蛋白轉(zhuǎn)化植物的報(bào)道。 煙草是生物學(xué)研究中的模式植物。具有生長(zhǎng)周期短，易培養(yǎng)等多種優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)以美洲商陸的葉片為材料提取基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PaAFP基因，切除內(nèi)含子，連接第一外顯子和第二外顯子，得到PaAFP基因cDNA片段。將PaAFP前體蛋白

3、基因與Ubi啟動(dòng)子、Nos終止子同時(shí)克隆于質(zhì)粒pCAMBIA1300中，構(gòu)建成為植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-PaAFP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過葉盤法侵染煙草，通過組培，得到轉(zhuǎn)基因植株。提取轉(zhuǎn)基因煙草總DNA，經(jīng)PCR，PCR-Southernblotting證實(shí)，PaAFP基因已整合到煙草基因組中。RT-PCR檢測(cè)證明，PaAFP基因已在轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄成mRNA，SDS-PAGE電泳中出現(xiàn)了與目的蛋白相應(yīng)分