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文檔簡介
1、非受體型酪氨酸激酶c-Abl是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳動物細胞內(nèi)的同源基因,在哺乳動物中廣泛表達。C-Abl蛋白具有豐富的結構域,其中SH3結構域能特異地識別富含脯氨酸殘基的蛋白區(qū)域,SH2結構域能特異地識別可被磷酸化的酪氨酸序列。通過NLS和NES結構在細胞核和細胞質(zhì)之間進行穿梭,使之定位于不同的亞細胞結構。絕大多數(shù)胞質(zhì)c-Abl通過其C端與G/F-肌動蛋白細胞骨架相連,從而調(diào)節(jié)F-肌動蛋白依賴的細胞骨架的變
2、化。C-Abl在正常生理及病理條件下具有多種生物學功能,參與細胞周期調(diào)控、細胞黏附遷移和細胞凋亡調(diào)控,并在氧化應激和DNA損傷修復過程中發(fā)揮重要的作用。
微管是一種細胞骨架結構,主要由微管蛋白α/β二聚體組成,具有支持細胞結構、固定細胞器位置的作用,并參與構成纖毛與鞭毛、神經(jīng)細胞軸突,另外還是中心體和紡錘體的重要組成部分。紡錘體在有絲分裂過程發(fā)揮著極其重要的作用,在有絲分裂期牽引染色體的移動并介導姐妹染色體的分離,在有絲分
3、裂末期引導收縮環(huán)的形成從而促進胞質(zhì)分裂。
PLK1和FOXM1是兩個與細胞周期有關的蛋白,它們都呈現(xiàn)細胞周期依賴性表達。FOXM1是一類DNA結合區(qū)具有翼狀螺旋結構的轉錄因子,屬FOX蛋白家族,主要參與細胞周期特異性基因的調(diào)節(jié),促進細胞增殖,它的表達和活性受許多增殖信號和抗增殖信號的調(diào)節(jié)。PLK1屬于Polo樣激酶家族,是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶,在細胞周期調(diào)節(jié)、細胞增殖、腫瘤發(fā)生等方面有重要作用。它們
4、都參與中心體和紡錘體的形成。FOXM1是PLK1激酶的底物,F(xiàn)OXM1也可以調(diào)節(jié)PLK1的表達,二者通過相互作用調(diào)節(jié)一系列細胞周期蛋白和因子,共同影響細胞周期。
本研究通過免疫沉淀和免疫印跡證實,c-Abl可以與PLK1相互作用,并磷酸化PLK1,因此PLK1是c-Abl激酶的底物。還通過細胞周期同步化的方法發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用以及c-Abl對PLK1的磷酸化都是隨細胞周期進程的變化而變化的。還通過熒光定量PCR和報告基
5、因檢測技術證實c-Abl可以促進FOXM1的轉錄;通過脈沖追蹤實驗證實c-Abl可以抑制FOXM1的降解;通過免疫印跡的方法證明c-Abl可提高FOXM1的蛋白水平,且這種作用依賴于c-Abl的激酶活性。因此c-Abl激酶通過與其底物PLK1相互作用并調(diào)節(jié)其磷酸化而間接影響了FOXM1的表達和蛋白穩(wěn)定性。
本研究中分離了聚合和溶解狀態(tài)的微管蛋白,通過免疫印跡的方法檢測了它們的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后溶解狀態(tài)的微管所占
6、比例升高,而聚合狀態(tài)所占微管的比例下降;又通過非變性PAGE膠分離了生理狀態(tài)的微管,發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后微管的聚合程度明顯下降,這說明c-Abl能夠抑制微管的解聚。還通過免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后細胞的微管結構變得模糊和彌散,說明c-Abl缺陷影響了微管的組裝。另外我們還用免疫印跡的方法比較了c-Abl敲低細胞中微管蛋白的水平,發(fā)現(xiàn)與野生型細胞相比,c-Abl敲低后微管蛋白的量明顯下降,這說明c-Abl可抑制微管蛋白的降解。
7、> C-Abl對微管聚合和組裝的影響勢必影響紡錘體的組裝。我們通過免疫熒光技術對有絲分裂期紡錘體進行了免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)c-Abl敲低后紡錘體的組裝出現(xiàn)缺陷。還發(fā)現(xiàn)非分裂期的c-Abl敲低細胞系中有許多多核細胞出現(xiàn),這說明c-Abl缺陷影響了胞質(zhì)分裂的正常進行。
本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的c-Abl底物PLK1,并初步證實c-Abl通過與PLK1相互作用和對PLK1進行磷酸化,進而通過多個途徑對細胞周期進行調(diào)節(jié)。C-Abl
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