家蠶Serpin家族蛋白酶抑制劑SW-AT-1性質(zhì)研究.pdf

1、蛋白酶抑制劑通過抑制蛋白酶的活性來調(diào)節(jié)蛋白酶的功能，在維持生命體的正常生長發(fā)育，抗蟲抗病等生命活動中發(fā)揮重要作用，廣泛分布于動植物、細(xì)菌、真菌和病毒等生物體內(nèi)。絲氨酸蛋白酶抑制劑（SPIs）是研究最為廣泛的一類蛋白酶抑制劑。SPIs主要調(diào)節(jié)蛋白酶的水解級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控動物體內(nèi)凝血反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和細(xì)胞凋亡等生命過程，在植物體中，絲氨酸蛋白酶抑制劑還可以防御昆蟲和病原菌的侵害，調(diào)控逆境中蛋白酶的過度水解破壞，增加機體的抗蟲抗菌性。按

2、照作用機理可以將絲氨酸蛋白酶抑制劑分為三類:典型絲氨酸蛋白酶抑制劑、非典型絲氨酸蛋白酶抑制劑、serpin類型絲氨酸蛋白酶抑制劑。典型絲氨酸蛋白酶采取傳統(tǒng)的鎖鑰模型結(jié)合底物，而serpin類型抑制劑則是通過活性中心環(huán)狀區(qū)(RCL)與底物以牢固的共價結(jié)合方式形成復(fù)合體，產(chǎn)生不可逆的抑制效果。
　　本論文對前期工作中通過活性電泳分離和MALDI-TOF-MASS質(zhì)譜鑒定得到的家蠶體壁胰蛋白酶抑制劑SW-AT-1的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。SW

3、-AT-1在UniProt登陸號為C7ASM9，在NCBI中的命名為silkworm antitrypsin isoform1(GenBank: FJ613793)，生物信息學(xué)分析表明該蛋白酶抑制劑負(fù)電荷殘基總數(shù)為49，正電荷殘基總數(shù)為42，在家蠶體內(nèi)屬于分泌蛋白，沒有跨膜區(qū)域。由Smart軟件的結(jié)構(gòu)分析中得知，SW-AT-1由一個serpin domain（28-390氨基酸殘基）和一段信號肽（1-16氨基酸殘基）組成。前期研究表明，

4、SW-AT-1同時具有抑制胰凝乳蛋白酶的作用。
　　對SW-AT-1蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及生物信息學(xué)分析顯示，SW-AT-1的RCL是結(jié)構(gòu)域中的一個凸出暴露區(qū)域，該區(qū)域是控制SW-AT-1功能的關(guān)鍵部位。SW-AT-1的關(guān)鍵作用位點由10個氨基酸組成，其中氨基酸位點G327，A328，E329和A330位于RCL的N-端，F(xiàn)352，N353，A354，N355，K356和P357位于RCL的C-端，通過PCR引物的設(shè)計對這10個氨基

5、酸進(jìn)行定點突變，將突變的基因片段與原核表達(dá)載體pET-28a連接，得到pET-28a-SW-AT-1及原核表達(dá)突變體G327A、A328G、E329G、A330G、F352A、N353D、A354G、N355S、K356G和P357G，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE-3，利用Ni-NTA親和層析法純化突變蛋白。SW-AT-1突變體的表達(dá)量分析表明，突變體原核表達(dá)的蛋白量均低于野生型，A328G的表達(dá)量僅為野生型的58％。結(jié)合serp

6、in的三級結(jié)構(gòu)分析可知，RCL的N端區(qū)域氨基酸殘基的突變會改變SW-AT-1的折疊方式，從而影響蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能，因此表現(xiàn)出蛋白表達(dá)量的下降。
　　純化10個突變體蛋白活性分析表明，突變體G327A和E329G在功能上表現(xiàn)出最大程度的抑制活性降低，對純化蛋白進(jìn)行酶動力學(xué)分析，計算出SW-AT-1及突變體與胰蛋白酶反應(yīng)的SI值為1.2、2.54、1.35、4.41、1.39、1.38、1.44、1.35、1.33、1.42、

7、1.3，SW-AT-1及突變體與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的SI值為1.3、2.44、4.25、1.3、1.45、1.48、1.4、1.5、1.38、1.35。SW-AT-1及突變體與胰蛋白酶反應(yīng)的ka為1.62×105M-1S-1、0.89×105M-1S-1、1.66×105M-1S-1、1.88×105M-1S-1、1.53×105M-1S-1、1.68×105M-1S-1、1.43×105M-1S-1、1.45×105M-1S-1、1.5

8、4×105M-1S-1、1.66×105M-1S-1，SW-AT-1及突變體與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的ka為1.77×104M-1S-1、3.12×104M-1S-1、1.27×104M-1S-1、4.13×104M-1S-1、2.77×104M-1S-1、3.02×104M-1S-1、2.36×104M-1S-1、2.97×104M-1S-1、2.54×104M-1S-1、3.41×104M-1S-1。SW-AT-1與胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶

9、的SI值表示反應(yīng)過程消耗抑制劑與底物酶分子量的比值，通過與突變體SI數(shù)值的比較可知，突變體G327A與E329G的SI數(shù)值大約達(dá)到野生型的3倍，表明SW-AT-1的RCL中327、329氨基酸的突變，導(dǎo)致了蛋白酶抑制劑抑制與底物酶結(jié)合能力降低，影響抑制劑的反應(yīng)效率。Ka可以直觀的反應(yīng)出SW-AT-1與底物酶反應(yīng)的速率。突變體G327A、E329G與野生型蛋白的k a值相差較大，G327和E329這兩個位點氨基酸的突變造成抑制劑與底物酶反

10、應(yīng)速率明顯下降。突變體與野生型純化蛋白SI與ka數(shù)值的測定，說明SW-AT-1的RCL結(jié)構(gòu)的N端兩個氨基酸殘基G327、E329是影響RCL發(fā)揮抑制活性的關(guān)鍵位點，這兩個位點氨基酸殘基的改變會引發(fā)SW-AT-1活性的明顯降低。
　　SW-AT-1基因分別與pCAMBIA-1304載體和插入CaMW35S-ubi串聯(lián)啟動子的pCAMBIA-1304載體連接后，構(gòu)建重組表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌侵染的方法將重組載體導(dǎo)入水稻懸浮細(xì)胞中，并在水