家蠶中孕酮受體膜元件2的(PGRMC2)的表達(dá)純化及功能初步分析.pdf

1、在家蠶cDNA文庫中篩選,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其與家蠶孕酮受體膜元件2有100％的同源性,又經(jīng)與SILKBase比對暫定這個(gè)序列是家蠶孕酮受體膜元件2,GenBank登陸號為DQ311390。該基因序列全長為772 bp,開放閱讀框大小為681bp,該基因編碼226個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測分子量大小為29.054 kD,等電點(diǎn)為5.67。根據(jù)PGRMC12基因的ORF框序列設(shè)計(jì)上下游引物,PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切,并插

2、入融合表達(dá)載體pET-28a的相應(yīng)酶切位點(diǎn),成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta(DE3),經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實(shí)重組正確。用濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)工程菌后,裂解菌體作SDS-PAGE分析,在29 kD左右的位置有一特異性蛋白條帶,與預(yù)期值相符。重組蛋白以可溶的形式表達(dá),利用親和層析的方法純化目的蛋白His-tag-PGRMC2,抗原免疫雄性新西蘭兔,制備了該重組蛋白的多克隆抗體。多克隆抗體經(jīng)Prote

3、in A凝膠柱純化,ELISA檢測抗血清的效價(jià)可達(dá)到1:25600以上。我們利用熒光定量PCR的方法,對家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期,以及五齡幼蟲各組織中的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明目的蛋白在蛹期和生殖腺、絲腺中表達(dá)量較高。提取家蠶五齡幼蟲的各組織蛋白,用于Western blotting實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PGRMC2蛋白在家蠶的卵、五齡幼蟲、蛹期和生殖腺、表皮、脂肪體中均有表達(dá),且隨著家蠶的發(fā)育PGRMC2蛋白的表